Generation teratoma nella Capsule Testicolo

Nota: Tutte le procedure sugli animali deve essere approvato dal IACUC o equivalente. Tutte le attrezzature chirurgiche devono essere sterilizzati prima dell'intervento chirurgico. Guanti sterili, garze e drappi devono essere utilizzati. 1. Preparazione prima dell'intervento Ottenere 6 settimane vecchie Mus musculus CbySmn.CB17 Prkdc-SCID / J topi maschi o altro ceppo immunocompromessi del mouse. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici, guanti e garze. Dissociano hPSCs deve essere iniettato con accutase. Contare le cellule e risospendere 1.000.000 cellule per 20-30 pl in matrigel diluito 1:1 in DMEM/F-12. Mantenere le cellule in ghiaccio fino al termine. Si noti che spesso è utile fare una corsa attraverso dell'esperimento in cui viene iniettato Trypan Blue. Questo aiuterà ad identificare i potenziali problemi prima che le cellule sono sprecati. Nel vivarium, anestetizzare il mouse in base alle procedure accettate presso l'istituto. Nei nostri esperimenti, abbiamo utilizzato un AnesthESIA macchina con isoflurano. I topi sono stati inizialmente messi in una camera di induzione con l'ossigeno e il 3-4% 1L/min isoflurano. Una volta anestetizzato, un cono con l'ossigeno e il 2-3% 1L/min isoflurano è stato utilizzato. Shave l'addome con un rasoio, e pulire la parete anteriore dell'addome topo, a partire dal centro del ventre e di lavoro verso l'esterno in senso orario. In primo luogo l'uso povidone-iodio soluzione quindi lavare con etanolo al 70%. Ripetere 3 volte, ogni volta cambiando tamponi. Trasferire l'animale a una piastra elettrica per mantenere l'animale caldo all'interno di una coltura di tessuto o cappuccio dissezione. Effettuare una incisione 1 centimetro longitudinale attraverso la cute e peritoneo sterili con forbici chirurgiche appena sotto il livello dell'articolazione dell'anca. Tenendo il peritoneo con le pinze, raggiungere verso il fianco destro con un altro forcept sterile ed estrarre il tessuto grasso bianco con testicoli collegati. Posizionare i testicoli su garza sterile. Riempire un (1 cc) tubercolina o wi siringa Hamiltoni th hPSCs da iniettare. Si noti che è una buona idea di includere una linea di controllo hPSC che si sa è pluripotenti come WA09 (noto anche come H9). In questo modo si dispone di un controllo positivo che è possibile utilizzare per determinare se l'iniezione o l'intervento chirurgico era difettosa. Iniettare lentamente il hPSCs (20-30 ml) nel centro della capsula testicolo lontano da vasi sanguigni più grandi, fermandosi se la capsula testicolare inizia a gonfiarsi. Rimuovere l'ago lentamente per evitare il riflusso delle cellule. Utilizzando pinze, trasferire i testicoli e schiena tessuto adiposo nella sua posizione originale nell'addome. Primo piano il peritoneo con 2 o 3 punti di sutura riassorbibili e chiudere la pelle con autoclips. Il mouse deve essere tenuto caldo fino a quando non recupera e dato qualche forma di analgesico (vedi ciò che è accettato nel Vivarium) dopo l'intervento chirurgico due volte al giorno per 1-2 giorni. Si noti che né l'anestesia né l'analgesico con interferire con lo sviluppo del tumore. Monitorare °animale e per la crescita del tumore per 6-12 settimane. Molto raramente, tumori possono crescere a 5 mm di dimensioni precedenti a 6 settimane dopo l'iniezione, quindi è importante monitorare gli animali. In questo caso, gli animali devono essere sacrificati ed i tumori trattati ed analizzati come al solito. Una volta che il tumore è palpabile e raggiunge circa 5 millimetri di dimensioni, anestetizzare il mouse e il sacrificio secondo le procedure di animali accettati protocollo. Rimuovere tumorale e di conseguenza il documento – fotografia formato, misura, pesare. Tagliare in piccoli pezzi del tumore e fissare in una soluzione di paraformaldeide al 4%. Conservare in paraformaldeide al 4% fino campioni sono inviati ad un patologo di sezionamento, colorazione e analisi. 2. Rappresentativi Risultati: Quando questo protocollo è effettuata come descritto e la linea cellulare è iniettato pluripotenti, uno palpabile, visivamente evidente, tumore dovrebbe formare entro 12 settimane al massimo. Per le linee stabilite hPSC come WA09, di solito si vedatumori entro 6 settimane. Per le linee IPSC non è raro vedere i tumori entro 8-10 settimane. È molto importante per iniettare topi con una linea che è noto per essere pluripotenti, come controllo positivo, per essere sicuri che la procedura è stata eseguita correttamente. I tumori di solito guardano molto eterogeneo e hanno molte cisti allegati (Figura 1). L'analisi dei campioni tumorali da un patologo deve mostrare tessuti differenziati da tutti i tre strati germinali (Figura 2). Figura 1. Tipica teratoma hPSC derivato nella capsula testicolo. Seguendo il protocollo descritto, un milione WA09 cellule sono state iniettate nella capsula testicolo di un topo immune compromesso. Sei settimane dopo, un teratoma è stata osservata. A) teratoma tirato dal mouse. B) Primo piano immagine del teratoma. Notare le strutture eterogeneità e cisti. <img alt="Figura 2" src = "/ files/ftp_upload/3177/3177fig2.jpg" /> Figura 2. Ematossilina Eosina e le sezioni colorate dal teratoma mostrano tessuti provenienti da ogni strato germinale. Dopo fissazione, il teratoma era sezionati e colorati con ematossilina ed eosina. Analisi da un patologo rivelato la presenza di cellule provenienti da ciascuno dei 3 strati germinali.