Çok parametreli Langendorff perfüze Tavşan Kalp Optik Haritalama

1. Hazırlık Taze yapılmış Tyrodes 'çözüm (128,2 NaCl, 1.3 mM CaCl 2, 4.7 KCl, 1.19 NaH 2 PO 4, 1.05 NaHCO 3 MgCl 2, 20.0 ve 11.1 glukoz) hazırlayın. Çözümler günlük hazırlık hızlandırmak için, önceden iki stok çözelti hazırlamak ve bunları saklamak +4 ° C soğutma sistemi: (1) Menkul Kıymetler (g/2L, 374,6 NaCl, 9.56 CaCl 2, 17,52 KCl, 8,21 NaH 2 PO 4 , 10.67 MgCl 2) ve (2) Stok II (g/2L, 84,01 NaHCO 3). Tyrodes bir deneyde olmak için yeterli bir çözüm 2L yapmak için, Stok, Stok II 80ml, ve glikoz 4g 80ml deiyonize su ve karıştırın 1840mL. Boyalar ve uncouplers stok çözümleri hazırlayın: (1) eksitasyon-kasılma uncoupler blebbistatin stok solüsyonu (DMSO Tocris Bioscience, 2mg/mL çözüm), (2) voltaj duyarlı boya di-4-ANEPPS stok solüsyonu (Invitrogen, 1mg/ml DMSO solüsyonu), (3) voltaj duyarlı boya RH 237 stok solüsyonu (Invitrogen, DMSO 1.25mg/ml çözüm), (4) kalsiyum göstergesi Rhod-02:00 stok solüsyonu (Invitrogen, DMSO 1mg/ml çözüm). Tek bir tavşan deney di-4-ANEPPS stok solüsyonu, 30 mcL RH237 stok solüsyonu ve Rhod 02:00 stok solüsyonu 200 mcL yaklaşık 30 mcL gerektirir. Tekrarlanan dondurma ve çözme önlemek için, -20 ° C'de di-4-ANEPPS 100 mcL alikotları depolamak Diğer boyalar da -20 ° C'de saklanır. Çözünmüş blebbistatin +4 ° C buzdolabında saklayın. 2L şişeye kalp, transfer Tyrodes 'çözüm hasat önce ve 37 çözüm sıcaklık sağlayan bir su banyosunda (Fisher Scientific) ° C içine yerleştirin % 5 CO 2 – Çözüm% 95 O 2 ile oksijenli. PH 7.35 tutulur ± 0.05 oksijenlenme düzeyini ayarlayarak. Çözüm Langendorff perfüzyon sisteminde dolaşan ve net bir naylon filtre (gözenek boyutu: 11μm, Millipore) tarafından filtre önce perfüzyon hattı kanül yerleştirilir. Kalp hasat öncesi izleme ekipmanları hazırlayın. Bir basınç dönüştürücü (TEFE), deney sırasında aort basıncı izlemek için kullanılır. Basınç dönüştürücü Temel kalp perfüzyon sistemine bağlı değilken mmHg sıfıra ayarlanır. Pseudo-EKG elektrotları yaklaşık Kurşun I, II ve III Einthoven üçgeni EKG odasına yerleştirilir. 2. Tavşan Kalpler Hasat ve Perfüzyon Tavşan tavşan süzgeç sabitleyin. Sodyum pentobarbital (50 mg / kg) 2000 U heparin intravenöz enjeksiyon yoluyla tavşan Euthanize. Tavşan ağrı refleksi eksikliği belirlendiği, tamamen ötenazi olduğunda, göğüs boşluğu hızla açıldı ve kalp ve akciğerler eksize. Arkus aorta dalları önce aort artan üst ucunda bir kesim olun. Asendan aorta hava temizleme ve sonra hızlı bir şekilde, daha önce koroner hava uzak tutmak için çok önemli bir kabarcık Tuzakçı bağlı olan bir kanül, 16-gauge kalp cannulate. Kalp retrograd olmayan bir sirkülasyon Langendorff perfüzyon sistemi perfüze sonra, bir kesim hızla perikard açık olun. Kan perfüzyon kızarmış ise, akciğer, trakea, yağ ve bağ dokuları çıkarın. Çok önemli! Silikon tüp (~ 3 cm çapında, uzun, ve 2mm), pulmoner ven ve mitral kapak yoluyla sol ventrikül (LV) içine yerleştirilir ve deney boyunca orada muhafaza edilir. Bu tüp LV sıkışıp çözüm bültenleri. Mekanik immobilize kalp Langedorff-perfüzyon deney sırasında saat dolaşımı olmadan, LV boşluğunda, ciddi iskemi neden ve aritmi üretmek için muhtemeldir. Sirkülasyon Langendorff-perfüzyon sistemi optik haritalama aparatı ile kanül ile kalp taşıyın. 3. Panoramik Optik Haritalama Sistemi kullanılarak yapılan deneyler yürütülmesi Ismarlama bir altıgen odasında kalp yerleştirin ve kanül perfüzyon sistemine bağlamak. Perfüzyon pompa akış hızını ayarlayarak aort basıncı 60 ± 5 mmHg koruyun. Ben sözde-EKG yol izleyin. Yaklaşık 7.35 pH ± 0.05 koruyun. Blebbistatin spektrumun görünen kısmı UV ve düşük sonunda (450-490 nm) 17 photoinactivated çünkü, oda ışığı kapatın. Yavaş yavaş enjeksiyon portu üzerinden kanül üzerinde bulunan hava balonu Tuzakçı blebbistatin stok solüsyonu enjekte edilir. Yavaş yavaş her bolus enjeksiyon için 0.1ml blebbistatin enjekte edilir. Sonraki enjeksiyon basıncı dengelemek için önce bekleyin. Pacing elektrod deneysel tasarım özel konumu üzerine yavaşça yerleştirin. Her foto-diyot dizinin görüntü düzlemi (PDA) bulunan buzlu cam kalp üç görüntüye odaklanınkalp çevresindeki açıları eşit aralıklı. Üç PDA alan görüş kalp sığdırmak için kanül ve her PDA ve kalp arasındaki mesafeleri konumunu ayarlayın. Buzlu cam her odaklı görüntü bir fotoğraf çekin. Yavaş yavaş 10 enjekte ~ perfüzyon çözüm içine hava kabarcığı tuzak enjeksiyon portu üzerinden 20μL di-4-ANEPPS stok solüsyonu. Optik kayıtlar almadan önce 1 ~ 3 dakika bekleyin. Ilk kayıt için, yeşil LED ışığı (herhangi bir eksitasyon filtresi, LED TAŞKIN, LUMILEDS) açmak ısmarlama veri toplama sistemi ile bağlantılı üç PDA'lar, 5 optik kayıtları aynı anda almak ve LED ışığı kapatın . Üç PDA farklı piksel sinyallerin kalitesini kontrol edin. 0.1 ~ 0.2mL blebbistatin stok solüsyonu optik aksiyon potansiyeli hareket eserler fark ettiniz. Sinyal-gürültü oranı düşük ise, başka bir 5 mcL di-4-ANEPPS stok çözüm ekleyin. Fonksiyonel çalışma için tasarlanmış deneysel protokol bitirin. Sinyal photobleaching ya da yıkanmaya nedeniyle deneyler sırasında bozulur ek 5μL di-4-ANEPPS stok solüsyonu ile kalp yeniden leke. Fonksiyonel çalışmanın tamamlanmasından sonra oda ışığı açın. 36 eşit aralıklı açılardan kalp fotoğraflar çekin. Bu, tek bir PDA yerde sabit bir dijital kamera ile 10 ° bir adım kalp döndürerek elde edilir. Kalp odasının dışarı çekin. Tüm çözümler boşaltın. DI su,% 70 reaktif alkol, ve yine DI su sırası perfüzyon sistemi yıkayın. Veri analizi, 36 dijital fotoğraf, yeniden inşa geometri yüzeye optik sinyal kaydı ve aksiyon potansiyeli süresi (AKB) ölçümü, iletim hızı (CV), faz, vb 6 kalp geometri yeniden yapılanma 4. Çift Haritalama Sistemi kullanılarak yapılan deneyler yürütülmesi (Part 2 sonra Devam) bir cam odası (Radnoti) kanüllü kalp ve kanül perfüzyon sistemine bağlamak. Kalp ventriküler apeks ve kulakçıklar odasının silikon altına sabitleyin. Oda ışığı kapatın. Yavaş yavaş kalp hareketsiz perfüzyon kanülü için önce enjeksiyon portu üzerinden (10μM ulaşmak için 15 ~ 20 dk) blebbistatin stok solüsyonu enjekte. Epikardiyal yüzeyi üzerinde bir plastik Petri kabı veya diğer cam pencere kapağı, çözüm yüzey hareketi azaltmak için koyun. Aynı alanda çift haritalama sistemi (Ultima-L, SciMedia) iki CMOS kamera odaklanın. Yayılan floresans dikroik ayna (635 nm kesme, Omega Optik) tarafından ayrılmış ve gerilim sinyalleri için 700nm longpass filtresi (Thorlabs) ve kalsiyum sinyaller için 590/30 nm band geçiren filtre (Omega Optik) tarafından filtre edilir. Daha fazla aydınlatma elde etmek için haritalama alanında doğru; iki halojen lambalar (SciMedia, Costa Mesa, CA Newport Oriel Instruments, Stratford, CT) ışık kılavuzları yöneltin. Tahrik olma filtreler (531/40 nm, SemRock) kullanılır. Leke enjeksiyon portu üzerinden voltaj duyarlı boya RH 237 stok solüsyonu (10 ~ 30 mcL) ile kalp. Pluronic F-127 ile Rhod 02:00 (0.2mL) stok solüsyonu (Invitrogen, 1:1 karışımı) karıştırın. Su-banyo sonikatör 1dk sonikasyon. Kabarcık Tuzakçı bağlantı noktası üzerinden karışımı enjekte edilir. Rhod-2 de esterleştirme haritalandırma başlamadan önce izin için yaklaşık 20 dakika bekleyin. Çözüm yüzeyinde hareket önlemek için tek bir kayıt için superfusion pompa kapatmak; ikaz ışık kaynağı (halojen lambalar) açın; veri toplama sistemi (Ultima-L, SciMedia) bağlı iki kameralar kullanarak optik kayıtları alabilir. ikaz ışıkları kapatmak ve superfusion pompası açmak. Optik sinyallerin kalitesini kontrol edin. Doku gerekirse yeniden leke. Bir çalışma için tasarlanmış deneysel protokol geri kalanını tamamlayın. Oda ışığı açın ve kalp görüş alanını içeren bir fotoğraf çekmek. Kalp odasının dışarı çekin. Tüm çözümler boşaltın. DI su,% 70 oranında reaktif alkol (Fisher Scientific) ve DI su sırası perfüzyon sistemi yıkayın. Veri analizi AKB, CV, kalsiyum geçici süresi (CaTD), AP yukarı doğru vuruş ve CAT yükselişi, kalsiyum geçici yükselme zamanı, ve Kedi çürüme bir monoexponential uyum sürekli zaman arasındaki gecikme ölçümleri içerir. Temsilcisi Sonuçlar: Şekil 1 Temsilcisi panoramik optik haritalama sistemi kullanarak bir Langendorff perfüze tavşan deney sonuçları. (A), üç boyutlu mesh-grid yüzey şeklinde tavşan kalp ve yeniden inşa tavşan kalp geometri ön görünümü. (B) Tepikardiyal yüzeyi açılmamış renk kodlu taşiaritmi bir atağı sırasında kırmızı ile gösterilen wavefront gösteren faz (faz düzlemi analizi 18 ile elde edilen). (C), istikrarlı bir evresel aritmi döngüsü sırasında aktivasyon wavefront (kırmızı renk) yayılma paneli B. (D) Sekiz anlık görüntülerini 1-5 ile işaretlenmiş faz tekillik genelinde beş optik aksiyon potansiyeli kayıtları. Wavefront çevrelerinde kalbin ön yüzeyinde görünür bir faz tekillik, etrafında saat yönünde. Repolarizasyon için renk (mavi) arka wavefront (örneğin, 80ms, 100ms, 120ms) görülebilecek şekilde kısmen saydam olarak ayarlanır. Bu evresel aritmi bir film tamamlayıcı video 1 sağlanmaktadır. Geometri yeniden yapılanma, sinyal kaydı, faz harita hesaplanması, ve yüzey açılması için yöntemler başka bir yerde 6 detaylı olarak açıklanmıştır. Şekil 2 çift haritalama sistemi (geçici aksiyon potansiyeli ve kalsiyum eş zamanlı haritalama) kullanarak Langendorff-perfüze tavşan kalbinde deney Temsilcisi sonuçları. Siyah noktalarla kaplı görünümü haritalama alanı ile (A) kalbin ön yüzey. (B) A kayıtları tek bir sitede yakın görünümü. (C) Örnek aksiyon potansiyeli izleri (mavi) ve kalsiyum, tüm piksel kayıtlar gösterilir ve mekansal çözünürlükte 200μm paneli A. Not siyah noktalar işaretlenmiş eşit aralıklı yerlerde bir dizi geçici (kırmızı).