Multiparametrische Optical Mapping der Langendorff-perfundierten Rabbit Heart

1. Vorbereitung Bereiten Sie frisch zubereitete Tyrodes "-Lösung (in mM, 128.2 NaCl, 1,3 CaCl 2, 4,7 KCl, 1,19 NaH 2 PO 4, 1,05 MgCl 2, 20,0 NaHCO 3, und 11,1 Glucose). Zur Beschleunigung der täglichen Zubereitung von Lösungen, bereiten zwei Stammlösungen im Voraus und speichern Sie sie bei +4 ° C Kühlschrank: (1) Lager I (in g/2L, 374,6 NaCl, 9,56 CaCl 2, 17,52 KCl, 8.21 NaH 2 PO 4 , 10,67 MgCl 2) und (2) Lager II (in g/2L, 84,01 NaHCO 3). Um 2L von Tyrodes "-Lösung genügt für einen Versuch nehmen 1840mL VE-Wasser und mischen in das 80 ml Lager I, 80ml von Lager II und 4g Glukose. Stammlösungen von Farbstoffen und Entkoppler: (1) Erregung und Kontraktion Entkoppler blebbistatin Stammlösung (Tocris Bioscience, 2mg/mL Lösung in DMSO), (2) Spannung Farbstoff di-4-ANEPPS Stammlösung (Invitrogen, 1mg/ml Lösung in DMSO), (3) Spannung Farbstoff RH 237-Stammlösung (Invitrogen, 1.25mg/ml Lösung in DMSO), (4) Calcium-Indikator Rhod-2AM Stammlösung (Invitrogen, 1mg/ml Lösung in DMSO). Ein einzelnes Kaninchen Experiment erfordert etwa 30 ul der di-4-ANEPPS Stammlösung, 30 ul des RH237 Stammlösung und 200 ul der Rhod-2AM Stammlösung. Um zu vermeiden, wiederholtes Einfrieren und Auftauen, speichern wir 100 ul Aliquots von di-4-ANEPPS bei -20 ° C. Andere Farbstoffe sind auch bei -20 ° C gelagert Bewahren Sie die gelösten blebbistatin in +4 ° C Kühlschrank. Vor der Ernte das Herz, Transfer Tyrodes "-Lösung in die 2L Flasche und legen Sie sie in ein Wasserbad (Fisher Scientific), die die Temperatur der Lösung hält bei 37 ° C. 5% CO 2 – Die Lösung wird mit 95% O 2 mit Sauerstoff versorgt. Der pH-Wert ist um 7.35 gepflegt ± 0,05 durch Anpassung der Sauerstoffversorgung Ebene. Die Lösung ist in der Langendorff Perfusion System zirkuliert und wird durch ein Nylonnetz (Porengröße: 11μm, Millipore) gefiltert in die Perfusion Zeile vor der Kanüle gelegt. Bereiten Überwachungsgeräte vor der Ernte das Herz. Ein Druckwandler (WPI) wird verwendet, um den Aortendruck während des Experiments zu überwachen. Baseline der Druckaufnehmer wird angepasst, um mmHg Null, wenn das Herz nicht auf die Perfusion System angeschlossen. Pseudo-EKG-Elektroden sind in der Kammer zur Angleichung Ableitung I, II und III der Einthoven Dreieck EKG gestellt. 2. Ernte und Perfusion des Kaninchenherzen Fix das Kaninchen in das Kaninchen restrainer. Euthanize das Kaninchen durch eine intravenöse Injektion von Natrium-Pentobarbital (50 mg / kg) mit 2000 U Heparin. Wenn das Kaninchen völlig eingeschläfert, die durch die Abwesenheit von Schmerz-Reflex bestimmt wird, ist der Brusthöhle schnell geöffnet und das Herz und die Lunge herausgeschnitten. Machen Sie einen Schnitt am oberen Ende der aufsteigenden Aorta, bevor alle Zweige des Aortenbogens. Spülen Sie die Luft aus der aufsteigenden Aorta und dann schnell kanülieren das Herz einer 16-Gauge Kanüle, die zuvor zu einer Blase Trapper, die sehr wichtig für die Reinhaltung von Luft aus der Koronarien verbunden ist. Sobald das Herz retrograd in einem nicht-rezirkulierenden Langendorff Perfusion System perfundiert, um einen Schnitt zu den Herzbeutel schnell zu öffnen. Entfernen Sie die Lungen-, Luftröhren-, Fett-und Bindegewebe, während das Blut durch die Perfusion gespült. Sehr wichtig! Ein Silikon-Schlauch (~ 3cm lang und 2 mm Durchmesser) wird durch eine Lungenvene und Mitralklappe in den linken Ventrikel (LV) eingefügt und dort während des Experiments. Dieses Rohr gibt die Lösung, die in der LV gefangen ist. Ohne Umlauf Stunden während der Langedorff-Perfusion Experiment in einer mechanisch immobilisiert Herz, ist es wahrscheinlich zu schweren Ischämie in der LV Hohlraum führen und Herzrhythmusstörungen zu produzieren. Bewegen Sie das Herz mit der Kanüle der Rückführung Langendorff-Perfusion mit der optischen Abbildung Apparat. 3. Experimente mit dem Panoramic Optical Mapping System Legen Sie das Herz in eine maßgeschneiderte Sechseck Kammer und verbinden Sie die Kanüle auf die Perfusion System. Pflegen Sie die Aortendruck bei 60 ± 5 mmHg durch Anpassung der Strömungsgeschwindigkeit des Perfusionspumpe. Monitor führen I pseudo-EKG. Pflegen Sie die pH-Wert bei etwa 7,35 ± 0,05. Schalten Sie das Licht ausgesetzt, weil blebbistatin durch UV-und Low-End-(450-490 nm) 17 von den sichtbaren Teil des Spektrums photoinactivated ist. Langsam injizieren blebbistatin Stammlösung durch den Ansaugstutzen in die Luftblase Trapper über die Kanüle entfernt. Langsam injizieren 0.1ml blebbistatin für jeden Bolus-Injektion. Warten Sie, bis der Druck zu stabilisieren, bevor die nächste Injektion. Gently Ort der Stimulation Elektrode auf die Lage speziell auf Ihre experimentelles Design. Stellen Sie das Bild des Herzens in das Milchglas in der Bildebene von jedem Foto-Dioden-Array (PDA) befindet sich aus dreigleichmäßig verteilte Winkel um das Herz. Passen Sie die Position der Kanüle und die Abstände zwischen den einzelnen PDA und das Herz, um das Herz in die field-of-view aller drei PDAs fit. Machen Sie ein Foto jedes fokussiertes Bild in das Milchglas. Langsam injizieren 10 ~ 20 &mgr; l di-4-ANEPPS Stammlösung durch den Ansaugstutzen in der Luft-Blasenfalle in der Perfusionslösung. Warten Sie 1 ~ 3 Minuten vor der Einnahme von optischen Aufnahmen. Für die erste Aufnahme, drehen Sie die grüne LED (keine Anregungsfilter, LED FLOOD, LUMILEDS) auf, nehmen optische Aufnahmen gleichzeitig von drei PDAs mit dem Custom-made-Datenerfassungssystem angeschlossen, 5 und schalten Sie das LED-Licht. Prüfen Sie die Qualität der Signale von verschiedenen Pixel alle drei PDAs. Add 0,1 ~ 0,2 ml blebbistatin Stammlösung wenn Bewegungsartefakte in der optischen Wirkung Potential bemerkt werden. Weitere 5 ul di-4-ANEPPS Stammlösung, wenn das Signal-Rausch-Verhältnis ist gering. Beenden Sie die entworfen experimentelle Protokoll für die funktionelle Studie. Re-Fleck das Herz mit zusätzlichen 5μL di-4-ANEPPS Stammlösung, wenn das Signal verschlechtert während der Experimente durch Ausbleichen oder Auswaschen. Schalten Sie die Raumbeleuchtung nach Abschluss der funktionellen Studie. Nehmen Sie Bilder des Herzens aus 36 gleichmäßig verteilten Winkeln. Dies wird durch Drehen des Herzens bei einem Schritt von 10 ° mit einer digitalen Kamera auf den Speicherort einer PDA feste erreicht. Nehmen Sie das Herz aus der Kammer. Lassen Sie alle Lösungen. Waschen Sie die Perfusion System in der Reihenfolge der DI-Wasser, 70% Reagenz Alkohol, und wieder DI-Wasser. Die Datenanalyse umfasst die Rekonstruktion des Herzens Geometrie aus den 36 digitalen Fotos, die Registrierung der das optische Signal auf der Oberfläche der rekonstruierten Geometrie und Quantifizierung der Dauer des Aktionspotentials (APD), Leitgeschwindigkeit (CV), Phase, etc. 6 4. Experimente mit dem Dual-Mapping System (Weiter nach Teil 2) Platzieren Sie den kanülierten Herzen in ein Glas Kammer (Radnoti) und verbinden Sie die Kanüle auf die Perfusion System. Pin unten das Herz an das Silizium Boden der Kammer an der Herzspitze und Atrien. Schalten Sie das Licht ausgesetzt wird. Langsam injizieren blebbistatin Stammlösung (15 ~ 20 min bis 10 um zu erreichen) durch den Ansaugstutzen vor Perfusionskanüle zum Herzen zu immobilisieren. Legen Sie eine Kunststoff-Petrischale oder andere Glasscheibe abdecken, oberhalb der epikardialen Oberfläche, um die Bewegung der Lösung Oberfläche zu reduzieren. Focus zwei CMOS-Kameras im dualen System zur Kartierung (Ultima-L, SciMedia) zur gleichen Sichtfeld. Emittierte Fluoreszenz wird von einem dichroitischen Spiegel (635 nm-Cutoff, Omega Optical) getrennt und gefiltert durch eine 700nm Langpassfilter (Thorlabs) für Spannungssignale und ein 590/30 nm Bandpassfilter (Omega Optical) für Calcium-Signale. Richten Sie den Lichtleiter aus zwei Halogenlampen (Newport Oriel Instruments, Stratford, CT; SciMedia, Costa Mesa, CA) in Richtung des Mapping-Bereich im Hinblick auf eine gleichmäßige Ausleuchtung zu erreichen. Anregung Filter (531/40 nm, Semrock) verwendet werden. Stain das Herz mit der Spannung Farbstoff RH 237-Stammlösung (10 ~ 30 ul) durch den Ansaugstutzen. Mix der Rhod-2AM (0,2 ml) Stammlösung mit Pluronic F-127 (Invitrogen, 1:1-Mischung). Ultraschallbad für 1 Minute in einem mit Wasser Ultraschallbad. Injizieren Sie die Mischung durch die Blase Trapper-Port. Warten Sie ca. 20 Minuten, damit die de-Veresterung der Rhod-2 AM, bevor Kartierung beginnt. Für eine Aufnahme, schalten Sie die Pumpe an Superfusion Bewegung an der Oberfläche der Lösung zu vermeiden, schalten Sie den Anregungslichtquelle (die Halogenlampen), nehmen optische Aufnahmen mit beiden Kameras mit dem Datenerfassungssystem (Ultima-L, SciMedia) ; schalten Sie das Anregungslicht, und schalten Sie die Pumpe Superfusion. Prüfen Sie die Qualität der optischen Signale. Re-Fleck das Gewebe, wenn nötig. Beenden Sie den Rest des entworfenen experimentellen Protokoll für eine Studie. Schalten Sie die Raumbeleuchtung und ein Lichtbild des Herzens, die das Sichtfeld. Nehmen Sie das Herz aus der Kammer. Lassen Sie alle Lösungen. Waschen Sie die Perfusion System in der Reihenfolge der DI-Wasser, 70% Reagenz Alkohol (Fisher Scientific) und DI-Wasser. Datenanalyse enthält Messungen der APD, CV-, Calcium-Transienten Dauer (CaTD), die Verzögerung zwischen AP Aufstrich und CAT steigen, die Anstiegszeit des Calcium-Transienten und die Zeitkonstante eines monoexponentielle fit of the Cat Verfall. Repräsentative Ergebnisse: Abbildung 1. Repräsentative Ergebnisse einer Langendorff-perfundierten Kaninchen Experiment mit der Panorama-optischen System zur Kartierung. (A) Die vordere Ansicht des Kaninchens Herz und die rekonstruierte Kaninchen Herzen Geometrie in Form einer dreidimensionalen Mesh-grid Oberfläche. (B) Twickelte er epikardialen Oberfläche farblich von der Phase (aus der Phasenebene Analyse 18) unter Angabe der Wellenfront in rot während einer Episode von Tachyarrhythmie gezeigt. (C) Die optische Wirkung Potenzial Aufnahmen aus fünf Standorten rund um die Phase Singularität von 1-5 in Feld B (D) Acht Snapshots der Aktivierung Wellenfront (rote Farbe) Ausbreitung markiert während eines Zyklus von einer stabilen reentrant Arrhythmie. Die Wellenfront Kreise um eine Phase Singularität, die sichtbar an der vorderen Oberfläche des Herzens ist im Uhrzeigersinn. Die Farbe für Repolarisation (blau) eingestellt wird teilweise durchsichtig, so dass der hintere Wellenfront sichtbar ist (zB bei 80ms, 100ms, 120ms und). Ein Film dieser reentrant Arrhythmie ist in der ergänzenden Video 1 zur Verfügung gestellt. Die Methoden zur Geometrie Wiederaufbau-, Signal-Registrierung, die Berechnung der Phase Karte und Oberfläche Auspacken sind im Detail an anderer Stelle 6 beschrieben. Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse aus einer Langendorff-perfundierten Kaninchen Herzen Experiment mit dem Dual-Mapping-System (gleichzeitige Abbildung von Aktionspotential und Kalzium transient). (A) Die vordere Fläche des Herzens mit der Mapping-Sichtfeld von schwarzen Punkten übersät. (B) A Nahaufnahme von Aufnahmen von einem Standort. (C) Sample Spuren Aktionspotential (blau) und Kalzium-Transienten (rot) aus einem Array von gleichmäßig verteilten Standorten durch die schwarzen Punkte in Panel A. Beachten Sie, dass nicht alle Pixel-Aufnahmen gezeigt werden und die räumliche Auflösung ist 200 um markiert.