Multiparametrische Optische kaart brengen van de Langendorff-geperfuseerde Rabbit Heart

1. Voorbereiding Bereid vers gemaakte Tyrodes 'oplossing (in mm, 128.2 NaCl, 1,3 CaCl2, 4,7 KCl, 1,19 NaH 2 PO 4, 1,05 MgCl 2, 20,0 NaHCO 3, en 11,1 glucose). Te versnellen de dagelijkse bereiding van oplossingen, voor te bereiden twee stockoplossingen van tevoren en bewaar ze bij +4 ° C koelkast: (1) Stock I (in g/2L, 374,6 NaCl, 9,56 CaCl 2, 17.52 KCl, 8,21 NaH 2 PO 4 , 10.67 MgCl 2) en (2) Voorraad II (in g/2L, 84.01 NaHCO 3). Te maken 2L van de oplossing Tyrodes 'voldoende voor een experiment duurt 1840mL gedeïoniseerd water en meng er in 80 ml van Stock I, 80ml van Stock II, en 4g van glucose. Bereid voorraad oplossingen van kleurstoffen en uncouplers: (1) excitatie-contractie ontkoppelrail blebbistatin stockoplossing (Tocris Bioscience, 2mg/mL oplossing in DMSO), (2) voltage-gevoelige kleurstof di-4-ANEPPS stockoplossing (Invitrogen, 1mg/ml oplossing in DMSO), (3) voltage-gevoelige kleurstof RH 237 stockoplossing (Invitrogen, 1.25mg/ml oplossing in DMSO), (4) calcium indicator Rhod-2AM stockoplossing (Invitrogen, 1mg/ml oplossing in DMSO). Een enkel konijn experiment vereist ongeveer 30 pi van de di-4-ANEPPS voorraadoplossing, 30 pi van de RH237 voorraadoplossing, en 200 pi van de Rhod-2AM stamoplossing. Om te voorkomen dat herhaaldelijk bevriezen en ontdooien, slaan we 100 pi fracties van di-4-ANEPPS bij -20 ° C. Andere kleurstoffen worden ook opgeslagen bij -20 ° C. Bewaar de opgeloste blebbistatin in +4 ° C koelkast. Vóór de oogst het hart, de overdracht Tyrodes 'oplossing in de 2L fles en plaats deze in een waterbad (Fisher Scientific), die de oplossing temperatuur blijft op 37 ° C. De oplossing is zuurstof met 95% O 2 – 5% CO 2. De pH wordt gehandhaafd op 7,35 ± 0,05 door het aanpassen van de oxygenatie niveau. De oplossing is verspreid in de Langendorff perfusie-systeem en wordt gefilterd door een nylon net filter (poriegrootte: 11μm, Millipore) geplaatst in de perfusie lijn voordat de canule. Vooraf voor te bereiden bewakingsapparatuur de oogst het hart. Een drukopnemer (WPI) wordt gebruikt om de aorta druk tijdens het experiment te controleren. Basislijn van de drukopnemer wordt aangepast aan mmHg nul wanneer het hart niet aan de perfusie-systeem. Pseudo-ECG-elektroden worden geplaatst in de kamer te benaderen Lead I, II en III van de Einthoven driehoek ECG. 2. Oogsten en perfusie van Rabbit Hearts Bevestig het konijn in het konijn restrainer. Euthanaseren het konijn door een intraveneuze injectie van natrium pentobarbital (50 mg / kg) met 2000 U heparine. Als het konijn is volledig gedood, die wordt bepaald door het ontbreken van pijn reflex, is de borstholte snel geopend en het hart en de longen zijn weggesneden. Maak een snee aan de bovenkant van de aorta ascendens voordat alle takken van de aortaboog. Spoel de lucht uit de aorta ascendens en dan snel het hart canule om een ​​16-gauge canule, die eerder is bevestigd aan een zeepbel trapper dat is heel belangrijk voor het houden van lucht uit hartinfarcten. Zodra het hart is retrogradely geperfundeerd in een niet-recirculerende Langendorff perfusie-systeem, maakt een snee aan het hartzakje snel te openen. Verwijder de longen, luchtpijp, vet en bindweefsel, terwijl het bloed wordt gespoeld door de perfusie. Zeer belangrijk! Een silicone (~ 3cm lang, en 2 mm in diameter) wordt ingebracht via een longader en mitralisklep in de linker ventrikel (LV) en daar gehouden gedurende het experiment. Deze buis brengt de oplossing die is gevangen in de LV. Zonder circulatie voor uren tijdens de Langedorff-perfusie experiment in een mechanisch geïmmobiliseerd hart, is het waarschijnlijk tot ernstige ischemie veroorzaken in de LV holte en aritmie te produceren. Verplaats het hart met de canule aan de recirculatie Langendorff-perfusie-systeem met de optische mapping apparaat. 3. Uitvoeren van experimenten met behulp van de Panoramic Optical Mapping System Plaats het hart in een op maat gemaakte zeshoek kamer en sluit de canule op de perfusie-systeem. Handhaving van de aorta druk bij 60 ± 5 mmHg door het aanpassen van het debiet van de perfusie pomp. Monitor lead I pseudo-ECG. Handhaven van de pH-waarde rond de 7,35 ± 0,05. Zet de kamer licht, omdat blebbistatin is photoinactivated door UV-en low end (450-490 nm) 17 van het zichtbare deel van het spectrum. Injecteer langzaam blebbistatin voorraad oplossing door de injectiepoort in de lucht-bubble trapper boven de canule. Injecteer langzaam 0,1 ml blebbistatin voor elke bolus injectie. Wacht tot de druk om te stabiliseren voordat de volgende injectie. Plaats voorzichtig de pacing elektrode op de locatie specifiek zijn voor uw experimenteel ontwerp. Focus het beeld van het hart in het matglas gelegen aan het beeldvlak van elke foto-diode-array (PDA) uit driegelijkmatig hoeken rondom het hart. Pas de positie van de canule en de afstand tussen elke PDA en het hart om het hart te passen in het veld-of-view van alle drie de PDA's. Maak een foto van elk scherp beeld in het matglas. Injecteer langzaam 10 ~ 20μL di-4-ANEPPS voorraad oplossing door de injectiepoort in de lucht-bubble trap in de perfusie-oplossing. Wacht 1 tot 3 minuten voordat optische opnames. Voor de eerste opname, zet u de groene LED licht (geen excitatie filter, LED OVERSTROMINGEN, LUMILEDS) op, gelijktijdig optische opnamen van drie PDA's die verband houden met de op maat gemaakte data-acquisitiesysteem, 5 en zet de LED-licht. Controleer de kwaliteit van de signalen van verschillende pixels van alle drie de PDA's. Voeg 0,1 ~ 0,2 ml blebbistatin voorraad oplossing als bewegingsartefacten in het optische actiepotentiaal worden opgemerkt. Voeg nog een 5 ul di-4-ANEPPS voorraadoplossing als signaal-ruis-verhouding laag is. Finish de ontworpen experimentele protocol voor de functionele studie. Re-vlekken op de hart met extra 5μL di-4-ANEPPS voorraad oplossing wanneer het signaal verslechtert tijdens de experimenten te wijten aan fotobleken of wash-out. Zet de kamer licht na de voltooiing van de functionele studie. Maak foto's van het hart van 36 gelijkmatig verdeeld hoeken. Dit wordt bereikt door het draaien van de hart op een stap van 10 ° met een digitale camera vast op de locatie van een PDA. Haal het hart uit de kamer. Giet alle oplossingen. Was de perfusie-systeem in de volgorde van de DI-water, 70% reagens alcohol, en weer DI water. Data-analyse omvat de reconstructie van het hart geometrie van de 36 digitale foto's, de registratie van het optische signaal op het oppervlak van de gereconstrueerde geometrie, en de kwantificering van actie potentiaal duur (APD), geleidingssnelheid (CV), fase, enz. 6 4. Uitvoeren van experimenten met behulp van de Dual Mapping System (Ga na deel 2) Plaats de canule hart in een glazen kamer (Radnoti) en sluit de canule op de perfusie-systeem. Vastpinnen het hart naar het silicium bodem van de kamer op de ventriculaire apex en atria. Zet de kamer licht. Injecteer langzaam blebbistatin stockoplossing (15 ~ 20 min tot 10μM te bereiken) via de injectiepoort voorafgaand aan de perfusie canule naar het hart te immobiliseren. Leg een plastic petrischaaltje of andere glazen venster te dekken, boven de epicardiale oppervlak om de beweging van de oplossing oppervlak te verminderen. Focus twee CMOS-camera's in het duale mapping systeem (Ultima-L, SciMedia) in hetzelfde beeldveld. Uitgezonden fluorescentie wordt gescheiden door een dichroïsche spiegel (635nm cutoff, Omega Optical) en gefilterd door een 700nm longpass filter (Thorlabs) voor spanning signalen en met een 590/30 nm bandpass filter (Omega Optical) voor calcium signalen. Richt de lichtgeleiders van twee halogeenlampen (Newport Oriel Instruments, Stratford, CT, SciMedia, Costa Mesa, CA) naar het in kaart brengen gezichtsveld zelfs verlichting te bereiken. Excitatie filters (531/40 nm, SemRock) worden gebruikt. Vlek het hart met de voltage-gevoelige kleurstof RH 237 stockoplossing (10 ~ 30 pi) via de injectiepoort. Meng de Rhod-2AM (0,2 ml) voorraad oplossing met Pluronic F-127 (Invitrogen, 01:01 mengsel). Sonificeer 1 minuut in een waterbad ultrasoonapparaat. Injecteer het mengsel via poort de bel Trapper's. Wacht ongeveer 20 minuten om de de-verestering van de Rhod-2 AM voor in kaart brengen van start. Voor een opname, schakelt u de superfusie pomp om beweging te voorkomen aan het oppervlak van de oplossing, zet de excitatie lichtbron (de halogeen lampen); nemen optische opnamen met behulp van beide camera's aangesloten op het data-acquisitie-systeem (Ultima-L, SciMedia) , zet de excitatie licht, en zet de superfusie pomp. Controleer de kwaliteit van de optische signalen. Re-vlekken op de weefsel indien nodig. Werk de rest van de ontworpen experimentele protocol voor een studie. Zet op de kamer licht en neem een ​​foto van het hart met het gezichtsveld. Haal het hart uit de kamer. Giet alle oplossingen. Was de perfusie-systeem in de volgorde van de DI-water, 70% reagens alcohol (Fisher Scientific) en DI water. Data-analyse bevat metingen van APD, CV, calcium voorbijgaande duur (CaTD), de vertraging tussen AP ophaal en Cat stijgen, de stijgtijd van het calcium van voorbijgaande aard, en de tijd constante van een monoexponential pasvorm van de CAT verval. Representatieve resultaten: Figuur 1. Representatieve resultaten van een Langendorff-doorbloed konijn experiment met behulp van de panoramische optische mapping systeem. (A) De voorste uitzicht over de konijn hart en de gereconstrueerde konijn hart geometrie in de vorm van een drie-dimensionale mesh-grid oppervlak. (B) Thij ongeopende epicardiale oppervlak kleur gecodeerd door de fase (verkregen uit de fase vlak-analyse 18) met vermelding van het golffront in rood aangegeven tijdens een aanval van tachycardie. (C) De optische actiepotentiaal opnames van vijf locaties in de fase van singulariteit gekenmerkt wordt door 1-5 in panel B. (D) Acht foto's van activering golffront (rode kleur) propagatie tijdens een cyclus van een stabiele reentrant aritmie. Het golffront cirkels met de klok mee rond een singulariteit fase, die zichtbaar is op de voorste oppervlak van het hart. De kleur voor de repolarisatie (blauw) is ingesteld om te worden gedeeltelijk doorzichtig, zodat de achterste golffront zichtbaar is (bijvoorbeeld op 80ms, 100ms, 120ms en). Een filmpje van deze re-entry aritmie is voorzien in de aanvullende video 1. De methoden voor geometrie wederopbouw, signaal registratie, berekening van de fase-kaart, en oppervlakte uitpakken worden beschreven in de details elders 6. Figuur 2. Representatieve resultaten van een Langendorff-doorbloed konijn hart experiment met de dubbele mapping systeem (gelijktijdig in kaart brengen van actiepotentiaal en calcium van voorbijgaande aard). (A) De voorste oppervlak van het hart met het in kaart brengen gezichtsveld onder de zwarte stippen. (B) Een close-up bekijken van opnames van een site. (C) Voorbeeld sporen van actiepotentiaal (blauw) en calcium van voorbijgaande aard (rood) uit een serie van gelijkmatig verdeelde locaties gekenmerkt door de zwarte stippen in paneel A. Merk op dat niet alle pixels opnames worden getoond en de ruimtelijke resolutie is 200μm.