تعيش خلية من التصوير و العقدية الرئوية الآلي باستخدام الميكروسكوب مرور الزمن
Summary
هذا البروتوكول ينص على إجراء خطوة بخطوة واحدة لرصد سلوك الخلية البكتريا المختلفة في الوقت المناسب باستخدام آلية مضان الوقت الفاصل بين المجهري. وعلاوة على ذلك ، فإننا نقدم إرشادات كيفية تحليل الصور المجهرية.
Abstract
خلال السنوات القليلة الماضية أصبح العلماء يدركون بشكل متزايد أن البيانات التي تم الحصول عليها من التجارب متوسط السكان الميكروبية تستند لا تمثل حالة أو سلوك أو النمط الظاهري واحد من الخلايا. بسبب هذه الرؤية الجديدة في عدد من الدراسات خلية واحدة ترتفع باستمرار (انظر الأخيرة للاستعراضات 1،2،3). ومع ذلك ، فإن العديد من التقنيات المطبقة خلية واحدة لا تسمح رصد تطور وسلوك خلية واحدة واحدة في وقت معين (مثل التدفق الخلوي المجهري أو قياسي).
هنا ، ونحن نقدم وصفا مفصلا لطريقة استخدام المجهر في العديد من الدراسات الحديثة 4 ، 5 ، 6 ، 7 ، والذي يسمح التالية وتسجيل (من مضان) الخلايا البكتيرية الفردية العصوية الرقيقة والعقدية الرئوية من خلال النمو والانقسام لأجيال كثيرة. يمكن استخدامها في الأفلام مما أدى إلى بناء شجرة النسب النشوء والتطور من خلال تتبع التاريخ مرة أخرى من خلية واحدة ضمن مجموعة من السكان التي نشأت من سلف واحد مشترك. ليس هذا فقط يمكن المجهري مضان الوقت الفاصل بين طريقة يمكن استخدامها لتحقيق النمو والانقسام والتفريق بين الخلايا الفردية ، ولكن أيضا لتحليل تأثير الخلية التاريخ والنسب على سلوك معين الخلوية. علاوة على ذلك ، يعتبر مثاليا الوقت الفاصل بين المجهري لدراسة ديناميات التعبير الجيني والتوطين البروتين خلال دورة الخلية البكتيرية. طريقة تشرح كيفية إعداد وبناء الخلايا البكتيرية الشريحة المجهر لتمكين ثمرة واحدة من الخلايا في microcolony. باختصار ، هي خلايا مفردة رصدت على سطح شبه صلبة تتكون من النمو المتوسط تستكمل مع agarose التي كانت تنمو وتنقسم تحت المجهر مضان داخل غرفة درجة الحرارة البيئية للرقابة. يتم التقاط الصور على فترات محددة ، ويتم تحليلها في وقت لاحق باستخدام البرمجيات مفتوحة المصدر ImageJ.
Protocol
Discussion
على النقيض من العديد من تقنيات خلية واحدة ، يمكن أن تستخدم في الوقت الفاصل بين الأسلوب المجهري مضان وصفها هنا لمتابعة التاريخ خلية محددة فيما يتعلق أسلافها ، سلوكها ، والأحداث الانقسام. بالاشتراك مع المروجين الهدف fluorescently المسمى أو البروتينات ، ويمكن تتبع مسار محدد تنشيط النمو في وقت والتوطين ، وكذلك البروتين يمكن رصدها خلال تطوير ديناميات البروتين البكتيري.
كما هو مبين أعلاه ، يمكن إجراء دراسات تركز على الأنواع البكتيرية المختلفة من خلال تكييف ظروف النمو وفقا لمتطلبات لجرثومة معينة. ترتبط القيود الوحيدة التي واجهناها لظروف النمو وحجم العينة. بسبب وجود بيئة مغلقة ، لا يمكن أن تتغير الظروف المتوسطة أثناء التجربة. وعلاوة على ذلك ، يمكن رصد مدة أقصاها أربع سلالات في التجربة بكفاءة.
ويمكن بسهولة النظر في بضع خطوات حاسمة ، فإن التحليل خلية واحدة الطريقة الموصوفة هنا يمكن تطبيقها باستخدام أي المجهر الآلي. في ما يلي ، سيتم إعطاء لمحة عامة عن هذه الخطوات الحاسمة. ويمكن الاطلاع على معلومات مفصلة في النص الرئيسي استعدادا العامة : ومن الحكمة أن تحقق من إعدادات ضبط تلقائي للصورة المطلوبة لجرثومة معينة قبل التجربة. وبالمثل ، ينبغي تحديد إعدادات الأمثل التقريبية لتصور مضان مقدما ، إذا أمكن ذلك. علاوة على ذلك ، أعدت بعد زمني يساعد على الحصول على جميع المواد جاهزة للاستخدام في الوقت المناسب (قبل ارتفاع درجة حرارة الغرفة المجهر ، برمجة الإعدادات المجهر ، وإعداد الشريحة قبل ساعة واحدة من الخلايا في مرحلة النمو المطلوبة ، انظر الشكل 1) . النمو باء يتم تعريف كيميائيا TLM وآلية التنمية النظيفة وسائل الاعلام المجاعة التي B. : الرقيقة في TLM وآلية التنمية النظيفة الرقيقة تنمو إلا ببطء. قد الفترة الزمنية التي تزرع الخلايا في وسائل الإعلام أن تكون طويلة اعتمادا على سلالة معينة. نمو بطيء يمنع الخلايا من تتراكم على بعضها البعض إعداد العينة المجهر : فقاعات الهواء بين الإطار الجيني ، وشريحة زجاجية وانزلاق الغطاء يجب أن تكون منعت لمنع جفاف واسعة من الوسط agarose مقرا لها. والشيء نفسه ينطبق على واجهة زلة متوسطة / الغطاء. فمن الأهمية بمكان السماح للخلايا جافة بدرجة كافية لمنع السباحة و / أو متعددة نمو طبقة من الزمن الفاصل بين المجهري مضان : ما قبل ارتفاع درجة حرارة الشريحة فضلا عن غرفة البيئية أمر حاسم لمنع حدوث مشاكل أوتوفوكس الرئيسية. يجب أن يتم تحديد الخلايا في منتصف اللوحة آغار ، لأن هذه لديها أعلى فرصة للبقاء في الميدان والتركيز خلال هذه التجربة (شريطة أن تكون العينة المجففة جيدا بما فيه الكفاية). كحد أقصى من 10 موقعا في التجارب لا تزال تعمل بشكل صحيح. بعد تحديد الخلية الأولى من الاهتمام فقط استخدام البرنامج لضبط التركيز (انظر النص للحصول على التفاصيل). تحقق ما إذا كانت الخلايا لا تزال في التركيز خلال الساعات الأولى من التجربة في فترات 30 دقيقة التحليل : من المهم أن تحقق قبل إجراءات تحليل ما إذا كان تمديد خلفية المتوسطة وقيم متشابهة في القنوات مضان. يمكن أن جزيئات الغبار الصغيرة والمتوسطة المكونات ، والعدسات القذرة أو كتل صغيرة agarose تسهم في زيادة مضان محليا ، مما يجعل من الصعب أو المستحيل فيلم لتحليل مشكلة اطلاق النار : إذا كانت الخلايا تنمو على رأس كل منهما الآخر ، وهذا قد يشير إما أن كانت ساترة تعلق قريبا جدا أو التي لا تناسب المتوسط لنمو monolayers microcolony. إذا الخلايا ذات الاهتمام يموت قبل الأوان بشكل مستمر ، بينما الخلايا الأخرى على الشريحة تقسيم لحسن الحظ ، قد تحتاج إلى التحقق ما إذا كان يمكنك وضع مرشح للأشعة فوق البنفسجية في الموقف. فإنه قد يساعد أيضا على تقليل مدة التعرض أو شدة الضوء خلال تجارب طويلة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم العمل في مجموعة من JWV من قبل الاتحاد الأوروبي إعادة الإدماج زمالة ماري كوري ، منحة Sysmo2 (NWO-ALW/ERASysBio) ، منحة الأفق (ZonMW) ، وزمالة VENI (NWO – ALW). يتم اعتماد مجموعة من المنح التي OPK STW عدة (NWO) ، وSYSMO1 (IGdeJ) وSYSMO2 منحة ، وكلية العلوم التربوية Eurocores SynBio المنح (SynMod) ، ومركز للجينوم Kluyver من التخمير الصناعية والمعهد الأعلى للغذاء والتغذية.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Gene Frame | ABgene | AB-0578 | 1.7 x 2.8 cm |
| high-resolution low melting agarose | Sigma | A4718 | |
| big cover slip | several | 24 x 50 mm | |
| if desired, membrane dye, e.g. FM 5-95 | Invitrogen | T23360 | other membrane dyes are also available: http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp34653.pdf |
| Time-lapse microscope with environmental chamber | several | see details for our device in the corresponding sections |
References
- Veening, J. W., Smits, W. K., Kuipers, O. P. Bistability, epigenetics, and bet-hedging in bacteria. Annu. Rev Microbiol. 62, 193-193 (2008).
- Dubnau, D., Losick, R. Bistability in bacteria. Mol Microbiol. 61, 564-564 (2006).
- Locke, J. C., Elowitz, M. B. Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells. Nat. Rev. Microbiol. 7 (5), 383-383 (2009).
- Veening, J. W. Bet-hedging and epigenetic inheritance in bacterial cell development. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105 (11), 4393-4393 (2008).
- de Jong, I. G., Veening, J. W., Kuipers, O. P. Heterochronic phosphorelay gene expression as a source of heterogeneity in Bacillus subtilis spore formation. J. Bacteriol. 192 (8), 2053-2053 (2010).
- Veening, J. W., Murray, H., Errington, J. A mechanism for cell cycle regulation of sporulation initiation in Bacillus subtilis. Genes Dev. 23 (16), 1959-1959 (2009).
- Eberhardt, A. Cellular localization of choline-utilization proteins in Streptococcus pneumoniae using novel fluorescent reporter systems. Mol Microbiol. 74 (2), 395-395 (2009).
- Vasantha, N., Freese, E. Enzyme changes during Bacillus subtilis sporulation caused by deprivation of guanine nucleotides. J Bacteriol. 144 (3), 1119-1119 (1980).
- Stewart, E. J. Aging and death in an organism that reproduces by morphologically symmetric division. PLoS. Biol. 3, 45-45 (2005).
- Rosenfeld, N. Gene regulation at the single-cell level. Science. 307 (5717), 1962-1962 (2005).
- Guberman, J. M. PSICIC: noise and asymmetry in bacterial division revealed by computational image analysis at sub-pixel resolution. PLoS. Comput. Biol. 4 (11), 1000233-1000233 (2008).
- Montero, L. l. o. p. i. s. . P. Spatial organization of the flow of genetic information in bacteria. Nature. 466, 77-77 (2010).
- Avery, O. T., Macleod, C. M., McCarty, M. Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types: Induction of transformation by a desoxyribonucleic acid fraction isolated from pneumococcus type III. J Exp. Med. 79, 137-137 (1944).
- Hoskins, . Genome of the bacterium Streptococcus pneumoniae strain R6. J Bacteriol. 183, 5709-5709 (2001).
- Martin, B. The recA gene of Streptococcus pneumoniae is part of a competence-induced operon and controls lysogenic induction. Mol Microbiol. 15, 367-367 (1995).
