Imaging in diretta degli assoni spinali dopo rizotomia
Summary
Un<em> In vivo</em> Immagini di protocollo per monitor principale assoni sensoriali seguenti schiacciare spinali è descritto. Le procedure di utilizzo ad ampio campo di microscopia a fluorescenza e topi transgenici Thy1-YFP, e permettere l'imaging ripetuta di rigenerazione degli assoni più di 4 cm nel SNP e le interazioni degli assoni con l'interfaccia del sistema nervoso centrale.
Abstract
Gli assoni sensoriali primarie ferito da lesioni radice spinale non riescono a rigenerarsi nel midollo spinale, con conseguente dolore cronico e permanente perdita di sensibilità. Rigenerazione della radice dorsale (DR) assoni nel midollo spinale è impedito l'ingresso in zona dorsale principale (DREZ), l'interfaccia tra il SNC e SNP. La nostra comprensione degli eventi molecolari e cellulari che impediscono la rigenerazione a DREZ è incompleta, in parte perché i cambiamenti complessi associati a danno del nervo sono stati dedotti dalle analisi post-mortem. Dinamica dei processi cellulari, come la rigenerazione degli assoni, sono i migliori studiati con tecniche che catturano eventi in tempo reale con le osservazioni più di ogni animale vivente. La nostra capacità di monitorare i neuroni in serie in vivo, è aumentato drammaticamente a causa di innovazioni rivoluzionarie nel campo dell'ottica e mouse transgenici. Diverse linee di Thy1-GFP topi transgenici, nei quali sottopopolazioni di neuroni sono geneticamente etichettati in distinti colori fluorescenti, consentono singoli neuroni di essere ripreso in vivo 1. Questi topi sono stati ampiamente utilizzati per imaging in vivo dei muscoli e del cervello 2-4 5-7, e hanno fornito indicazioni romanzo in meccanismi fisiologici che le analisi statiche non poteva essere risolto. Studi di imaging di neuroni nel midollo spinale di vita hanno cominciato solo di recente. Lichtman ei suoi colleghi hanno dimostrato la loro fattibilità per il monitoraggio feriti colonna dorsale (DC) assoni con grande campo microscopia 8,9. Multi-fotone in imaging in vivo di profondamente posizionati assoni DC, microglia e dei vasi sanguigni è stato anche compiuto 10. Nel corso degli ultimi anni, siamo stati i primi ad applicare imaging in vivo di monitorare la rigenerazione degli assoni DR utilizzando la microscopia a largo campo e la linea H del Thy1-YFP topi. Questi studi ci hanno portato ad una nuova ipotesi sul perché gli assoni DR viene impedito di rigenerazione nel midollo spinale 11.
In linea H del Thy1-YFP topi, distinto YFP assoni + sono posizionati superficialmente, che consente assoni diversi da monitorare contemporaneamente. Abbiamo imparato che gli assoni DR arrivare a DREZ sono meglio ripreso in lombare che nel midollo spinale cervicale. Nella presente relazione si descrivono diverse strategie che abbiamo trovato utile per assicurare il successo di imaging a lungo termine e ripetuti di rigenerare gli assoni DR. Tra questi metodi che eliminano l'intubazione ripetute e interruzione delle vie respiratorie, ridurre al minimo la chirurgia associata a stress e la formazione di cicatrici, e di acquisire immagini stabili ad alta risoluzione senza fototossicità.
Protocol
Discussion
Imaging DR rigenerazione direttamente in topi vivi è particolarmente impegnativa perché richiede una notevole laminectomia dorsale di monitorare la crescita degli assoni su una vasta area seguito da più interventi chirurgici invasivi e anestesia nelle sessioni successive di imaging. Diverse strategie aiutato a superare queste sfide. In primo luogo, l'imaging di successo richiede la riduzione della mortalità del mouse (circa il 25%), riducendo al minimo la durata dell'anestesia e sanguinamento, e da una metic…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dott. Alan Tessler per i commenti e aiuto editoriale. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH NS062320.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| H line thy1-YFP (2-4 months old, either sex) | Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) | 003782 | |
| Xylazine (AnaSed injection, sterile solution) | Lloyd Laboratories, (Shenandoah, LA) | 4811 | 8 mg/kg |
| Ketamine (Ketamine hydrochloride injection, USP) | Hospira, Inc. (Lake Forest, IL) | 2051 | 120 mg/kg |
| Buprenorphine (Buprenex injectable) (0.05 mg/kg) | Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc.(Richmond, VA) | 7571 | |
| Small animal hair clippers | Oster Professional, (McMinnville, TN) | 76059-030 | |
| Hair removal lotion | Church & Dwight Co (Princeton, NJ) | NAIR with Baby Oil | |
| Gauze sponges | Fisher Scientific, (Pittsburgh, PA) | 22-362-173 | |
| Cotton-tipped swabs | Fisher Scientific, (Pittsburgh, PA) | 14-960-3Q | |
| 1 mL syringes | Becton, Dickson and Company Franklin Lakes, NJ) | 309602 | |
| Subcutaneous (Sub-Q) needles, 26ga. | Becton, Dickson and Company (Franklin Lakes, NJ) | 305115 | |
| Spring scissors and forceps | Fine Science Tools, (Foster City, CA) | ||
| 2.5-mm curved rongeurs | Fine Science Tools, (Foster City, CA) | 16221-14 | |
| Lactated Ringer’s Injection USP | B. Braun Medical Inc., (Irvine, CA) | BBR-L7502 | |
| Sterile saline solution | APP Pharmaceuticals, (Schaumburg, IL) | 918610 | |
| Thin synthetic matrix membrane (Biobrane) | Bertek Pharmaceuticals, (Morgantown, WV) | 62794-096-251 | |
| Artificial dura | Gore Preclude MVP Dura Substitute, W.L. Gore and Associates, (Flagstaff, AZ) | 1MVP40 | |
| 5-0 silk sutures | Ethicon, Inc. (Somerville, NJ) | K-580 | |
| Wound clips | Perfect – Ets Bruneau, (Burnea, France) | A75 | |
| Fluorescent stereomicroscope | Leica Microsystems, (Wetzlar, Germany) | MZ16 | |
| CCD camera | Hamamatsu, (Bridgewater, NJ) | ORCA-Rx2 | |
| Temperature Controller | World Precision Instruments (Sarasota, FL) | ATC 1000 | |
| Metamorph software | Molecular Devices, (Sunnyvale, CA) | ||
| Photoshop | Adobe Systems, San Jose, CA |
References
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Watching the neuromuscular junction. J Neurocytol. 32, 767-775 (2003).
- Bishop, D. L., Misgeld, T., Walsh, M. K., Gan, W. B., Lichtman, J. W. Axon branch removal at developing synapses by axosome shedding. Neuron. 44, 651-661 (2004).
- Balice-Gordon, R. J., Lichtman, J. W. in vivo visualization of the growth of pre- and postsynaptic elements of neuromuscular junctions in the mouse. J Neurosci. 10, 894-908 (1990).
- Trachtenberg, J. T. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420, 788-794 (2002).
- Pan, F., Gan, W. B. Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex. Dev Neurobiol. 68, 771-778 (2008).
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3, 489-496 (2006).
- Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. in vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat Med. 11, 572-577 (2005).
- Misgeld, T., Nikic, I., Kerschensteiner, M. in vivo imaging of single axons in the mouse spinal cord. Nat Protoc. 2, 263-268 (2007).
- Davalos, D. Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Neurosci Methods. 169, 1-7 (2008).
- Maio, D. D. i. in vivo imaging of dorsal root regeneration: Rapid immobilization and presynaptic differentiation at the CNS/PNS border. Journal of Neuroscience. 31, 4569-4582 (2011).
