Disminuye la cuantificación cognitivos causados ​​por la radioterapia craneal

Nuestros paradigmas de pruebas cognitivas son esquemáticamente en el diagrama de la Figura 1. Las pruebas cognitivas se inicia un mes después de la irradiación y los procedimientos quirúrgicos se realizan. La realización de la plaza Novela Reconocimiento (NPR) de Trabajo El lugar de Novela Reconocimiento (NPR) de trabajo se basa en procedimientos descritos por Mumby y sus colegas (2002), y es una tarea de reconocimiento de memoria espacial que se basa en el hipocampo 4. Las ratas son los primeros familiarizado con el contexto de pruebas por su inclusión en los escenarios de prueba (a medida, blanco, cajas de acrílico, la parte superior abierta, 70cm X 70cm X 40cm de altura) durante 20 minutos una vez al día durante tres días. Los objetos que no se utilizará para las pruebas posteriores se colocan en la arena durante estas sesiones de habituación. Para la fase de habituación, observaciones manuales de conducta exploratoria debe tener en cuenta, mientras que el registro y seguimiento de la conducta no son necesarios. Para todas las fases de la tarea de NPR, la arena se limpian a fondo entre los animales con etanol al 70% con el fin de minimizar las señales de confusión de olores. Para todos los ensayos, los animales experimentadores lugar en el centro de los campos de prueba en una orientación coherente para minimizar la posibilidad de que los animales simplemente explorar el bloque que pasar a ser colocado al lado. La fase de familiarización y de 5 minutos fase de pruebas se administran en el cuarto día. Para la fase de familiarización, a dos cuadras de plástico idénticas (8 cm X 3 cm X 10 cm de alto) que han sido limpiados con etanol al 70% se colocan en posiciones específicas dentro de los escenarios de prueba. Un animal se coloca en cada campo durante 5 minutos y se les permite explorar libremente. Exploración de las dos posiciones espaciales por igual-familiar se califica utilizando el sistema de seguimiento automatizado. Para todas las fases, la exploración se define como punto de un animal de la nariz que dentro de un radio de 4 cm de y dirigida hacia los bloques. Paraguientes la fase de familiarización, los animales se colocan en una jaula pequeña propiedad para un intervalo de retardo de 5 minutos. Durante este tiempo, los escenarios de prueba son limpiados con etanol al 70%, y las copias idénticas de los bloques se añaden, uno en una posición idéntica espacial durante la fase de familiarización, y el otro en una posición espacial novela. Si una rata recuerda la disposición espacial de los bloques de la fase de familiarización, que invertirá más tiempo a explorar el bloque situado en la ubicación espacial de la novela. Después de que el intervalo de retardo de 5 minutos, los animales se devuelven a los escenarios de prueba para la fase de prueba de 5 minutos. Ellos exploran libremente durante 3 minutos. 24 horas después del final de la fase de familiarización, los animales se devuelven a los escenarios de prueba de nuevo para la fase de prueba de 24 horas. Para esta fase, a una cuadra se mantiene en la misma posición que durante la familiarización y 5 minutos en fases de prueba, y el otro bloque se coloca en una posición nueva, espacial novela. Una vez más, si una nueva ratalos miembros de la disposición espacial de los bloques de la fase de familiarización el día anterior, pasará más tiempo a explorar el bloque situado en la ubicación espacial de la novela. Ahora, la cantidad de tiempo dedicado a explorar los bloques en las posiciones espaciales diferentes se recoge mediante el programa de seguimiento automatizado, y se pueden analizar estadísticamente las diferencias entre los grupos experimentales. Para la fase de familiarización, el tiempo total dedicado a explorar los lugares espaciales a través de todo el juicio se calcula. No debería haber ninguna diferencia en el tiempo dedicado a explorar las dos localizaciones espaciales durante esta fase, ya que son igualmente familiar / desconocido para los animales (Fig. 2A). Por otra parte, diferencias significativas en la exploración total entre los grupos experimentales pueden indicar las variaciones en los niveles de motivación del grupo para explorar o ansiedad y se deben considerar en la interpretación de la memoria de reconocimiento espacial de los resultados de las dos fases de pruebas. Tanto para elA 5 minutos y 24 horas de las fases de prueba, una relación de exploración se calcula como sigue: el tiempo dedicado a explorar la posición de la novela – el tiempo dedicado a explorar la posición familiar / tiempo total dedicado a la exploración (Fig. 2B). De esta manera, la variabilidad individual en la motivación para explorar los objetos se tiene en cuenta. Animales normales pasan mucho más tiempo explorando la posición espacial de la novela lo esperado por azar (indicado por la línea discontinua) siguiendo los intervalos de retardo de 5 minutos y 24 horas (Fig. 2B). Relación de exploración se calcula típicamente durante los primeros 60 segundos de la prueba de 5 minutos y 24 horas-4. Esto es así porque, como el progreso de las pruebas ensayos, la posición espacial de la novela se vuelve más familiar a los animales. Por lo tanto, el primer minuto de los ensayos de prueba ofrece la evaluación más precisa de la memoria de reconocimiento espacial. 2. Llevar a cabo el laberinto elevado Plus (EPM) Tarea El elevadoAdemás de Maze (EPM) tarea se basa en los procedimientos de Walf y Frye, 2007 5. La tarea de EPM se utiliza para evaluar la ansiedad en roedores. El aparato de EPM es un laberinto de 4 brazos (45 "X 4") recaudó 45 "desde el nivel del suelo, con los brazos dispuestos en forma de plus. Dos brazos cerrados y dos abiertos. El aparato que se muestra es fabricado por Med Associates Inc . Comportamiento durante esta tarea refleja un conflicto entre la motivación natural de la rata para explorar nuevos ambientes (tiempo de permanencia en los brazos abiertos) y la preferencia por permanecer en áreas protegidas (brazos cerrados). La sala experimental es iluminado con focos apuntando al laberinto para garantizar una adecuada motivación para preferir el cierre, más tenuemente iluminada brazos. El laberinto se limpia a fondo antes de que el primer animal se pone a prueba, y entre cada prueba. El animal se coloca en el aparato ni lo sostenga en los miembros anteriores y colocarlo en la parte central del laberinto, frente al brazo abierto que está lejos deel experimentador. Cada prueba tiene una duración de 5 minutos. El camino de los animales se sigue utilizando el software de seguimiento automático para que el número de entradas y la cantidad de tiempo empleado en los brazos abiertos y cerrados se puede calcular. Comportamientos adicionales, tales como caídas de la crianza, el aseo y la cabeza sobre el lado del aparato se puede controlar. Una entrada se cuenta que el punto central de la cruza de animales en un brazo. Si una rata cae en el laberinto, es rápidamente colocado de nuevo en el brazo abierto desde el que cayó, y el evento se registra en el cuaderno de observación. Si una rata se congela durante un período prolongado de tiempo, el comportamiento, junto con las posibles causas (por ejemplo repente, un ruido fuerte fuera de la sala de ensayo) se observan, y las pruebas continúan de modo que todos los animales experimentales tienen tiempos de exposición similares. El tiempo empleado en los brazos abiertos frente al cerrado se usa para calcular la relación: el tiempo en los brazos abiertos / tiempo total de armas. Del mismo modo, la proporción de entradas a los brazos abiertos frente al total delas entradas se calcula el brazo. Utilizando el software de seguimiento automático, la distancia total recorrida y la velocidad también se puede medir con el fin de evaluar las diferencias en la función motora entre los grupos experimentales. Disminución de la ansiedad se asocia con una mayor proporción de tiempo dedicado en los brazos abiertos, mientras que aumento de la ansiedad y el miedo están asociados con más tiempo de permanencia en los brazos cerrados. Animales normales pasan mucho menos tiempo en los brazos abiertos lo esperado por azar (indicado por la línea punteada, Fig. 3).. Los animales más ansiosos pasan un tiempo proporcionalmente menor en los brazos abiertos, mientras que los animales menos ansiosos se pasan más tiempo en los brazos abiertos (por ejemplo, después de múltiples exposiciones a el laberinto o después del tratamiento fármacos ansiolíticos). 3. Llevar a cabo el acondicionamiento del contexto y con claves miedo (FC) de Trabajo Contextuales y complementada miedo Acondicionado (FC) descripción de las tareas se basan en procedimientos de SchafE et al., 1999, Winocur et al., 2006 y MacLeod et al., 2007 6-8. El condicionamiento del miedo (FC) La tarea es un paradigma de comportamiento en el que los animales aprendan a temer a un estímulo previamente neutro (un contexto, una luz o un tono, el estímulo condicionado) por la vinculación con los estímulos nocivos (por lo general un estímulo eléctrico plantar leve, el estímulo no condicionado ). El aprendizaje es rápido, robusto y de larga duración, y por lo tanto la tarea FC se utiliza a menudo para estudiar los circuitos neurobiológicos del aprendizaje y la memoria en roedores. El aparato FC es un 30cm X 30cm X 40cm de alto cámara cerrada (Phenotyper, modelo 3000, Tecnología de la Información Noldus). El suelo de la cámara consiste en una rejilla de acero inoxidable que son utilizados para entregar el estímulo de choque. El Phenotyper está equipado con un altavoz que emite un tono de 2300Hz, 90dB en la demanda, que actúa como estímulo condicionado. El choque se entrega a través de un generador de descargas (Med Associates Inc.). El choque es una incomodidad momentánea que no produce lasting dolor o daño en los tejidos. Tanto para la formación y los ensayos de prueba, la entrega de los golpes y los estímulos tono es programado y controlado de forma automática utilizando la XT Ethovision add-on Trial y el módulo de control de hardware (la versión 7.0, la tecnología Noldus de la Información). En el primer día, la formación FC se lleva a cabo. El Phenotyper se limpia cuidadosamente con etanol al 70%, y un solo animal se coloca en la cámara. El ensayo de formación consta de tres fases: (1) una fase inicial, cuando no de choque o el tono se administra, (2) una fase de entrenamiento, cuando el shock tono parejas se presentan, y (3) una fase posterior a la capacitación, cuando no choque o el tono se administra. Cada fase tiene una duración aproximada de 5 minutos para un tiempo de entrenamiento total del ensayo de 15 minutos por animal. Durante la fase de entrenamiento, el tono se administra durante 30 segundos y coincidiendo con el final del tono, un choque de 1 mA es entregada a la red durante 1 segundo. Este emparejamiento tono de choque que se repite un total de 5 veces, con una variable de 10 a 60 secoº espacio intervalo entre cada pareja. Desde la fase de entrenamiento, el porcentaje de tiempo que cada animal pasa inmóvil, o la congelación, se mide desde el final de 60 segundos de la fase inicial de referencia (para establecer la congelación espontánea antes de las parejas de descarga de tonos) y de los últimos 60 segundos del mensaje -la formación de fase (para establecer el comportamiento de congelación en respuesta a las parejas de descarga de tonos). Animales normales, muestran niveles muy bajos de congelación durante la fase basal y muy alta (95%) los niveles de congelación durante la fase de post-entrenamiento (Fig. 4). 24 horas más tarde, el animal se devuelve al contexto idéntico y lo observado para la prueba de FC 5 minutos contextual. No hay choque o el tono de nacer durante esta fase, y el porcentaje de tiempo dedicado a la congelación se calcula para todo el juicio. Tenga en cuenta la importancia de mantener el contexto de la capacitación constante para poner a prueba su contexto. De hecho, tener el mismo experimentador manejar y poner a prueba a los animales en los dos días es necessary. Animales normales gastan aproximadamente el 70% de la prueba contexto participado en comportamientos de congelación (Fig. 4). La prueba de FC con claves se administra una hora después. El contexto de la cámara se cambia mediante la eliminación de el suelo de rejilla, agregando paneles en la parte exterior de la cámara, y la limpieza del piso con un limpiador doméstico perfumadas. El comportamiento de la congelación de los animales se observa para el primer minuto, y los niveles de congelación es muy bajo si el contexto se ha cambiado lo suficiente (Fig. 4). El tono se juega durante 3 minutos, seguido por un último minuto de silencio, y el porcentaje de tiempo dedicado congelación se calcula. Animales normales muestran altos niveles de congelación durante este tiempo (Fig. 4). En total, cinco medidas discretas de comportamiento de congelación se recogen; (1) línea de base, (2) después de la formación, (3) prueba de contexto, (4) antes de la señal de prueba; (5) prueba de pista y después de cue-. Ausencia de heladas durante la fase inicial establece los niveles normales de ansiedad, mientras que sustancialmentecongelación potenciales durante la fase posterior a la capacitación sugiere intacta la capacidad sensorio-motor. Congelación durante la prueba de contexto establece 24 horas de memoria para el contexto de la formación, que se basa en la función del hipocampo y la amígdala intacta 9. A falta de la congelación de prueba pre-cue sugiere alteración suficiente para el contexto de la formación inicial. Congelación y posterior Cue cue-establece 24 horas de memoria para el estímulo de tono, que se basa en función de la amígdala intacta 9. 4. Llevar a cabo el laberinto acuático de Morris (MWM) Tarea Morris agua laberinto procedimientos de trabajo se basan en las descripciones anteriores 10,11. El laberinto acuático de Morris (MWM) la tarea es una prueba de aprendizaje espacial para los roedores que requiere el uso de señales distal para localizar una plataforma de escape sumergido en una gran piscina de agua turbia. Señales grandes y visuales, distintas se colocan alrededor de la piscina en lugares específicos, constante. Los animales aprenden a usar estas señales para desplazarse a la Submerged plataforma. Los animales son controlados y eliminados del agua si no son capaces de nadar. El aprendizaje espacial se evalúa a través de la repetición de pruebas y la memoria de referencia se determina mediante la evaluación de la preferencia por el área de la plataforma cuando la plataforma está ausente. Ensayos inversión de mejorar la detección de alteraciones espaciales, y puede gravar a otras regiones del cerebro tales como la corteza frontal 10. La tarea MWM se administra más de 8 días y consta de 4 fases, una prueba con claves, una fase de adquisición, una sonda de prueba de 24 horas y una prueba de reversión de aprendizaje. La piscina es una medida camiseta blanca, de polietileno, 200 cm de diámetro y 60 cm. Se llena con agua hasta unos 30 cm de profundidad y opaca de color blanco, pintura no tóxica. La temperatura del agua se mantiene entre 20 y 22 ° C (68 y 72 ° F). La plataforma de escape es un hecho a medida, soporte de plástico transparente con una circular de 10 cm de alto y diámetro. Se encuentra aproximadamente a 1,5 cm por debajo de la superficie de la water. La prueba con claves consta de 4 pruebas administrado el día 1. Para estos ensayos, una bandera distinta en blanco y negro se coloca en el centro de la plataforma para que la ubicación de escape es obvio para los animales. Para reducir al mínimo el uso de la información espacial durante esta fase, las señales de la pared se eliminan y la plataforma y comenzar a lugares son muy variados entre los ensayos. Esta fase ayuda a descartar la existencia de diferencias sensoriales relacionados con el motor entre los grupos experimentales antes de la fase de adquisición se inicia. Para todas las fases de la tarea de MWM, los animales se mantienen bajo las patas delanteras y se coloca suavemente en el agua en la posición de inicio designado, mirando a la pared de la piscina. Los animales se ponen a prueba en las cohortes de tal manera que hay un 8 a 10 minutos entre ensayos intervalo entre cada una de las cuatro pruebas diarias 8. Durante los intervalos entre ensayos, los animales son mantenidos en jaulas de calentamiento para evitar la hipotermia. Para la prueba con claves, un tiempo de nado máximo de 30 segundos se permite que el animal se suba alplataforma. Si el tiempo máximo se alcanza antes de los escapes de animales, el investigador que guía a la plataforma con la mano y la coloca en la plataforma. El animal permanece en la plataforma para un período de descanso de 20 segundos antes de ser colocado en una jaula de calentamiento. Para cada prueba de ensayo con claves, el animal se inicia desde una ubicación diferente, inicie pre-determinado en el perímetro de la piscina, y la plataforma también se trasladó a cada una de las cuatro posiciones diferentes cuadrantes. La fase de adquisición se inicia al día siguiente y se compone de 4 pruebas por día durante 5 días consecutivos. Durante esta fase, la plataforma oculta permanece en el mismo lugar y los animales aprenden a navegar hacia él con las señales habitación distal. Una vez más, para cada uno de los 4 ensayos, el animal se encuentre en la piscina en un punto diferente, empezar a pre-determinado. Cada día, dos de los puntos de inicio están a la izquierda y dos de los puntos de inicio están a la derecha de la plataforma, en orden aleatorio, para evitar el desarrollo de egocentric estrategias espaciales para resolver la tarea. El tiempo de nado máximo de cada ensayo de adquisición es de 60 segundos, tras lo cual el animal es guiado y colocado en la plataforma por el experimentador. El animal permanece en el programa durante 20 segundos después de escapar. El día 7, las 24 horas después de la prueba final del entrenamiento, un ensayo de la sonda de 60 segundos se administra en el que la plataforma se ha eliminado. Esta fase determina la preferencia del animal por el cuadrante que se usa para contener la plataforma y se utiliza como una medida de la memoria de referencia espacial 10. Después de la prueba de la sonda, la plataforma se devuelve al mismo cuadrante y tres ensayos de adquisición regular se administran. Para la reversión de aprendizaje de prueba en el día 8, la plataforma se mueve a una nueva ubicación con el fin de evaluar la capacidad de inversión de aprendizaje. Medir la cantidad de animales pasen la búsqueda de la plataforma en su ubicación anterior en comparación con su nueva ubicación ofrece una evaluación de la perseverancia, o el INAbilidad de suprimir la respuesta a la ubicación anterior una vez que la plataforma se ha movido 10. En cuanto a la adquisición y las fases de investigación, 4 de 60 segundos ensayos se administran. Para la prueba con claves, la latencia para encontrar la plataforma y la velocidad se utilizan como medidas de la función motora y visual, respectivamente. Las diferencias entre los grupos experimentales durante esta fase hay que tener en cuenta en la interpretación de los resultados de la adquisición y la memoria como las diferencias en la función sensorial-motor entre los grupos puedan existir. Para la fase de adquisición, con una media de latencia para encontrar la plataforma y / o longitud del camino se utilizan como medidas de aprendizaje espacial. En los animales normales, escapar de la latencia se reduce gradualmente durante los cinco días la adquisición de tal manera que el tiempo de escape media es de unos 15 a 20 segundos el día 5 (Fig. 5). Para la fase de investigación, la distancia media a la plataforma (Fig. 5B) y / o latencia de llegar primero a la ubicación anterior de la plataforma (Fig. 5C </strong>) se utilizan como medidas de la memoria de referencia espacial. Para la fase de inversión, el tiempo dedicado por ciento en el cuadrante viejo y lo nuevo que contiene la plataforma se utiliza como una medida de la perseverancia. En los cuatro ensayos, la preferencia por la localización de la plataforma de edad deben disminuir a medida que la preferencia por la ubicación de la nueva plataforma se ha establecido (Fig. 5D). 5. Los resultados representativos: Figura 1. Representación esquemática de los paradigmas de pruebas cognitivas. Figura 2. Los resultados representativos de los animales de control en la nueva tarea de reconocimiento a cabo. A) El tiempo total dedicado a explorar las dos posiciones espaciales debe ser aproximadamente igual durante la fase de familiarización. B) Exploración relación (tiempo dedicado a explorar nuevas posición / tiempo dedicado a explorar ambas posiciones) muestra una clara preferencia por la posición espacial de la novela siguiendo los intervalos de retardo de 5 minutos y 24 horas. La línea punteada indica el comportamiento de la casualidad. Figura 3. Los resultados representativos de los animales de control en el laberinto elevado. Animales normales pasan menos tiempo de lo esperado por azar en los brazos abiertos (indicado por la línea discontinua). Animales ansiosos pasan un tiempo proporcionalmente menor en los brazos abiertos en comparación con los controles, mientras que las exposiciones múltiples al laberinto o el tratamiento con ansiolíticos aumentará el tiempo dedicado en los brazos abiertos. Figura 4. Los resultados representativos de los animales de control en la tarea condicionamiento del miedo. Los bajos niveles de congelación se observan durante la exposición inicial a la cámara (punto de partida), Y cuando el contexto es alterado antes de la prueba de referencia (pre-señal de prueba). Por el contrario, los animales normales pasan la mayor parte del período posterior a la capacitación en conductas de congelación. Si los animales recordar el contexto en que la formación se produjo después de un retraso de 24 horas, se involucren en el comportamiento de la congelación de aproximadamente el 70% de la prueba contexto de 5 minutos. Del mismo modo, si los animales recordar el tono, que muestran altos niveles de congelación durante la prueba de pista y después de cue-. Figura 5. Los resultados representativos de los animales de control en la tarea laberinto de Morris. A) la latencia de escape disminuye con el entrenamiento progresivo durante la fase de adquisición. B) y C) Distancia media y la latencia para cruzar primero la localización de la plataforma anterior, durante la prueba de la sonda de 24 horas se utilizan como medidas de la memoria de referencia espacial. D) Inversión de aprendizaje es evaluado por el cambio de ubicación de la plataforma en el último día de los TESting. En los 4 ensayos, los animales normales gradualmente dejan de buscar en el cuadrante de edad y saber que la plataforma está en una nueva ubicación.