Quantifizierung Kognitive Dekrementiert von Cranial Strahlentherapie verursachten Schäden

Unsere kognitiven Tests Paradigmen sind schematisch in Abbildung 1 schematisch dargestellt. Kognitive Tests eingeleitet wird 1 Monat nach der Bestrahlung und chirurgische Eingriffe durchgeführt werden. Die Durchführung der Novel Ort Recognition (NPR) Aufgabe Der Roman spielt Recognition (NPR) Aufgabe ist es, die Verfahren durch Mumby und Kollegen (2002) beschrieben basiert, und ist eine räumliche Erkennung Speicher Aufgabe, die auf den Hippocampus 4 beruht. Ratten sind zunächst mit der Prüfung Kontext, indem sie in die Prüfung Arenen (custom-made, weiß, Acryl, offene Top-Boxen, 70cm X 70cm X 40cm hoch) für 20 Minuten einmal pro Tag für drei Tage vertraut gemacht. Objekte, die nicht für spätere Tests verwendet werden, sind in den Arenen während dieser Gewöhnung Sessions gelegt. Für die Eingewöhnungsphase sollte manuellen Beobachtungen von explorativen Verhalten darauf hingewiesen werden, während der Aufnahme und Verfolgung von Verhalten sind nicht erforderlich. Für alle Phasen des NPR Aufgabe werden die Arenen sorgfältig zwischen den Tieren mit 70% Ethanol, um verwirrende Geruch Hinweise zu minimieren gereinigt. Für alle Versuche, die Experimentatoren Ort Tieren in der Mitte des Tests Arenen in einer konsequenten Ausrichtung minimiert die Wahrscheinlichkeit, dass Tiere einfach erkunden den Block, dass sie neben platziert werden passieren. Die Einarbeitungsphase und 5-Minuten-Test-Phase auf dem vierten Tag verabreicht. Für die Einarbeitungsphase, sind zwei identische Kunststoff-Blöcke (8cm x 3cm x 10cm hoch), die sorgfältig mit 70% Ethanol gereinigt an spezifischen Positionen innerhalb des Tests Arenen gestellt. Ein Tier ist in jeder Arena während 5 Minuten platziert und erlaubt, sich frei zu erkunden. Exploration der beiden gleich vertrauten räumlichen Positionen erzielt wird mit dem automatisierten Tracking-System. Für alle Phasen, ist die Exploration als ein Tier die Nase Punkt innerhalb eines Radius von 4 cm und in Richtung der Blöcke definiert. Fürllowing der Einarbeitungsphase werden die Tiere in einem kleinen Käfig halten für einen 5-minütigen Verzögerung Intervall platziert. Während dieser Zeit werden die Tests Arenen mit 70% Ethanol gereinigt und identische Kopien der Blöcke hinzugefügt werden, eine in identischer räumlicher Position als während der Einarbeitungsphase und eine in einem Roman räumliche Position. Wenn eine Ratte erinnert sich an die räumliche Anordnung der Bausteine ​​aus der Einarbeitungsphase, wird es mehr Zeit für die Erkundung der Block in dem Roman räumliche Lage. Nach der 5-minütigen Verzögerung Intervall werden die Tiere für die Prüfung Arenen für die 5-Minuten-Testphase zurückgegeben. Sie frei erkunden für 3 Minuten. 24 Stunden nach dem Ende der Einarbeitungsphase werden die Tiere für die Prüfung Arenen wieder für die 24-Stunden-Test-Phase zurück. Für diese Phase, bleibt ein Block in der gleichen Position wie bei der Einarbeitung und 5-Minuten-Testphasen, und der andere Block wird in einem neuen, neuartigen räumlichen Position gebracht. Auch wenn eine Ratte reMitglieder der räumlichen Anordnung der Bausteine ​​aus der Einarbeitungsphase am Tag zuvor, wird er mehr Zeit damit verbringen die Erkundung der Block in dem Roman räumliche Lage. Nun ist der Zeitaufwand für die Erkundung der Blöcke in den verschiedenen räumlichen Positionen gesammelt in einem automatisierten Tracking-Programm, und können statistisch für die Unterschiede zwischen experimentellen Gruppen analysiert werden. Für die Einarbeitungsphase, verbrachte Gesamtzeit Erkundung sowohl räumliche Standorten in der gesamten Studie berechnet wird. Es sollte kein Unterschied in der Zeit erkunden die beiden räumlichen Orten während dieser Phase werden, da sie ebenso vertraut / unvertraut die Tiere (Abb. 2A). Ferner kann erhebliche Unterschiede in insgesamt Exploration zwischen den experimentellen Gruppen zeigen Gruppe Variationen in Motivation zu erkunden oder Angstzustände und sollte bei der Interpretation räumliche Erkennung Speicher ergibt sich aus den beiden Testphasen werden. Sowohl für die5-Minuten-und 24-Stunden-Test-Phasen, ist ein Explorations-Verhältnis wie folgt berechnet: Zeit entdecken neue Position – Zeit erkunden vertraut Position / Gesamtzeit erkunden (Abb. 2B). Auf diese Weise ist die individuelle Variabilität in der Motivation, um die Objekte zu erkunden berücksichtigt. Normale Tiere verbringen deutlich mehr Zeit mit der Erforschung des neuartigen räumlichen Position als durch Zufall (angedeutet durch die gestrichelte Linie) nach der 5-Minuten-und 24-stündiger Verspätung Abständen (Abb. 2B) erwartet. Exploration Verhältnis ist in der Regel für die ersten 60 Sekunden der 5-Minuten-und 24-Stunden-Tests 4 berechnet. Dies liegt daran, wie der Test Prozesse voranzubringen, wird die neue räumliche Lage besser kennen, um die Tiere. Somit stellt die erste Minute des Tests Studien die genaue Beurteilung der räumlichen Erkennung Speicher. 2. Die Durchführung der Elevated Plus Maze (EPM) Aufgabe Die erhöhtePlus Maze (EPM) Aufgabe ist es, über die Modalitäten von Walf und Frye, 2007 5 basiert. Die EPM Aufgabe wird benutzt, um Angst bei Nagern zu beurteilen. Die EPM Apparatur ist ein 4-Arm Labyrinth (45 "x 4") angehoben 45 "vom Boden, mit den Armen in ein Plus Form angeordnet. Zwei Arme umschlossen sind und zwei sind offen. Die gezeigte Vorrichtung von Med Associates Inc hergestellt wird . Verhalten bei dieser Aufgabe spiegelt einen Konflikt zwischen der Ratte die natürliche Motivation, neue Umgebungen zu erkunden (Zeit in offenen Armen verbracht) und Präferenz für den Verbleib in Schutzgebieten (geschlossenen Arme). Die experimentellen Raum ist hell mit Scheinwerfern in das Labyrinth wies auf entsprechende Motivation sorgen die geschlossene, mehr schwach beleuchteten Arme bevorzugen lit. Das Labyrinth ist gründlich, bevor das erste Tier getestet wird gereinigt, und zwischen jedem Versuch. Das Tier ist in das Gerät, indem es unter den Vorderbeinen und stellen Sie es in den mittleren Bereich des Labyrinths gesetzt, mit Blick auf den offenen Arm, die sich von sichder Experimentator. Jeder Versuch dauert 5 Minuten. Der Weg des Tieres ist ein Tracking mithilfe des automatischen Tracking-Software, so dass viele Einträge und viel Zeit in der offenen und geschlossenen Armen verbracht berechnet werden kann. Zusätzliche Verhaltensweisen wie Aufzucht, Pflege und Kopf taucht auf der Seite des Gerätes überwacht werden können. Ein Eintrag wird gezählt, wenn der Mittelpunkt des Tieres Kreuze in den Arm. Wenn eine Ratte fällt das Labyrinth, ist es schnell wieder auf dem offenen Arm, aus dem es fiel gelegt, und das Ereignis wird in der Beobachtung, Notebook aufgezeichnet. Wenn eine Ratte friert für einen längeren Zeitraum, sind das Verhalten, zusammen mit allen möglichen Ursachen (z. B. plötzliche, laute Geräusche außerhalb Testraum) stellte fest, und Tests fort, so dass alle Versuchstiere ähnliche Belichtungszeiten haben. Zeit im Freien gegenüber geschlossenen Armen verbracht wird verwendet, um das Verhältnis zu berechnen: Zeit in offenen Armen / Gesamtzeit in die Arme. Auch das Verhältnis der Einträge Arme und totale öffnenArm Einträge berechnet. Mit dem automatisierten Tracking-Software, reiste insgesamt Entfernung und Geschwindigkeit kann auch gemessen werden, um eventuelle Unterschiede in der motorischen Funktion zwischen experimentellen Gruppen zu beurteilen. Verminderte Angst ist mit einem größeren Anteil der Zeit in den offenen Armen verbracht assoziiert, während erhöhte Angst und Furcht mit mehr Zeit in der geschlossenen Armen verbracht verbunden sind. Normale Tiere verbringen deutlich weniger Zeit in die offenen Arme, als durch Zufall (angedeutet durch die gestrichelte Linie, Abb.. 3) zu erwarten. Mehr ängstlich Tiere werden entsprechend weniger Zeit in die offenen Arme zu verbringen, während weniger ängstlich Tiere mehr Zeit in die offenen Arme (zum Beispiel nach Mehrfachbelichtungen, um das Labyrinth oder nach anxiolytische medikamentöse Behandlung) zu verbringen. 3. Die Durchführung der Kontextuelle und Cued Angstkonditionierung (FC) Aufgabe Kontextuelle und Cued Angstkonditionierung (FC) Aufgabe Beschreibungen basieren auf Verfahren aus Schaf aufe et al., 1999, Winocur et al., 2006 und MacLeod et al. 2007 6-8. The Fear Conditioning (FC) Aufgabe ist es, eine Verhaltensänderung Paradigma, in denen Tiere lernen, einen zuvor neutralen Reiz (ein Kontext, ein Licht oder ein Ton, der konditionierte Reiz) Angst durch Paarung mit schädlichen Reiz (in der Regel eine milde Fußschock, der unbedingte Reiz ). Lernen ist eine schnelle, robuste und langlebige, und damit der FC Aufgabe wird oft auf die neurobiologischen Schaltung von Lernen und Gedächtnis in Nagetieren Studie verwendet. Der FC Apparatur ist ein 30cm X 30cm X 40cm hoch geschlossenen Kammer (Phenotyper, Modell 3000, Noldus Information Technology). Der Boden der Kammer besteht aus einem Edelstahl-Gitter, die verwendet werden, um den Schock Impulse liefern wird. Die Phenotyper ist mit einem Lautsprecher, die eine 2300Hz, 90dB Ton on demand emittiert ausgestattet, als die bedingten Reiz. Der Schock über ein Schock-Generator (Med Associates Inc.) geliefert. Der Schock ist eine momentane Unannehmlichkeit, die nicht las produziertting Schmerzen oder Gewebeschäden. Für Training und Test-Studien, ist die Auslieferung der Schock und Ton Reize zeitlich und kontrolliert automatisch mit dem Ethovision XT Add-on Trial und Hardware Control Module (Version 7.0; Noldus Information Technology). Am ersten Tag, ist der FC Training durchgeführt. Die Phenotyper wird gründlich mit 70% igem Ethanol gereinigt und ein einzelnes Tier ist in der Kammer gelegt. Das Training Studie besteht aus drei Phasen: (1) eine Grundlinie Phase, wenn kein Schock oder Ton verabreicht wird, (2) einer Trainingsphase, wenn Ton-Schock-Paarungen präsentiert werden, und (3) eine post-Trainingsphase, wenn keine Schlag oder Ton verabreicht wird. Jede Phase dauert etwa 5 Minuten für insgesamt Training Testzeit von 15 Minuten pro Tier. Während der Trainingsphase, den Ton für 30 Sekunden und fällt mit dem Ende der Ton verabreicht wird, ist ein 1mA Schock zum Stromnetz für 1 Sekunde geliefert. Dieser Ton-Schock-Paarung ist ein insgesamt 5-mal wiederholt, mit einer variablen 10 bis 60 second Intervall Abstand zwischen den einzelnen Paarung. Von der Trainingsphase, den Prozentsatz der Zeit jedes Tier verbringt regungslos, oder Einfrieren wird aus den letzten 60 Sekunden der ersten Baseline-Phase (spontane Einfrieren vor der Ton-Schock-Paarungen zu etablieren) und aus den letzten 60 Sekunden des post gemessen -training-Phase (zum Einfrieren Verhalten als Reaktion auf den Ton-Schock-Paarungen zu etablieren). Normale Tiere zeigen ein sehr niedriges Niveau des Einfrierens während der Baseline-Phase und sehr hoch (~ 95%) Ebenen des Einfrierens während der post-training-Phase (Abb. 4). 24 Stunden später wird das Tier auf die identischen Kontext zurück und beobachtet für die 5 Minuten kontextuellen FC zu testen. Kein Schlag oder Ton ist während dieser Phase geliefert, und der Prozentsatz der Zeit Einfrieren ist für die gesamte Studie berechnet. Beachten Sie die Bedeutung der Beibehaltung der Kontext konstant von der Ausbildung in Zusammenhang zu testen. In der Tat, mit der gleichen Experimentator Griff und testen Sie die Tiere an beiden Tagen ist neEinklang steht. Normale Tiere verbringen etwa 70% der im Rahmen Versuch in Gefrierpunkt Verhalten (Abb. 4) engagiert. Die cued FC-Test ist eine Stunde später verabreicht werden. Der Kontext der Kammer wird durch Entfernen des Gitters Boden und fügte hinzu, Paneele, die außerhalb der Kammer, und die Reinigung der Boden mit einem duftenden Haushaltsreiniger geändert. Das Tier friert Verhalten ist für die erste Minute beobachtet und Einfrieren ist sehr niedrig, wenn der Kontext ausreichend verändert worden (Abb. 4). Der Ton wird dann für 3 Minuten gespielt, gefolgt von einem letzten Minute des Schweigens, und den Prozentsatz der Zeit verbrachte das Einfrieren berechnet wird. Normale Tiere zeigen ein hohes Maß an Einfrieren während dieser Zeit (Abb. 4). Insgesamt sind 5 diskrete Maßnahmen des Einfrierens Verhalten gesammelt werden; (1) Baseline, (2) nach dem Training, (3) Kontext zu testen; (4) Vor-Cue-Test; (5) Cue-und post-Cue-Test. Das Fehlen des Einfrierens während der Baseline-Phase stellt normale Angst Ebenen, während substanTiAl Einfrieren während der post-Trainingsphase schlägt intakten sensomotorischen Fähigkeiten. Einfrieren während des Kontext-Test stellt 24-Stunden-Speicher für die Ausbildung Kontext, die auf intakte Hippocampus und Amygdala Funktion 9 setzt. Ein Mangel an Vor-Cue-Test Einfrieren schlägt ausreichende Veränderung der Erstausbildung Kontext. Cue und post-cue Einfrieren stellt 24-Stunden-Speicher für die Ton-Reiz, die auf intakte Amygdala Funktion 9 setzt. 4. Die Durchführung der Morris Water Maze (MWM) Aufgabe Morris Water Maze Task Verfahren basieren auf früheren Beschreibungen 10,11 basieren. Das Morris Water Maze (MWM) Aufgabe ist es, einen Test der räumlichen Lernen für Nager, die die Verwendung von distalen Cues, ein getauchtes Flucht-Plattform in einen großen Pool von undurchsichtigen Wasser zu finden erfordert. Große, deutliche visuelle Hinweise werden rund um den Pool in bestimmten, konstanten Orten platziert. Tiere lernen, diese Signale zu verwenden, um den su navigierenbmerged Plattform. Die Tiere werden überwacht und entfernt aus dem Wasser, wenn sie nicht schwimmen können. Spatial Lernen ist in wiederholten Versuchen und Referenz-Speicher wird durch die Ermittlung Vorliebe für die Plattform-Bereich, wenn die Plattform fehlt bestimmt beurteilt. Reversal Studien den Nachweis des räumlichen Beeinträchtigungen, und kann zusätzliche Hirnregionen wie dem frontalen Kortex 10 Steuern. Die MWM Aufgabe ist es, über 8 Tage verabreicht und besteht aus 4 Phasen, eine cued Test, eine Akquisition Phase, eine 24-Stunden-Probe-Test und eine Umkehr Lernen zu testen. Der Pool ist eine maßgeschneiderte weiß, Behälter aus Polyethylen, 200 cm im Durchmesser und 60cm hoch. Es wird mit Wasser auf ca. 30 cm tief und undurchsichtig mit weißem, ungiftige Farbe gefüllt. Die Wassertemperatur bleibt erhalten zwischen 20 und 22 ° C (68 und 72 ° F). Die Flucht-Plattform ist eine maßgeschneiderte, durchsichtigen Kunststoff-Ständer mit einem kreisförmigen top Mess-10cm im Durchmesser. Es liegt ca. 1,5 cm unter der Oberfläche des water. Die cued Test besteht aus 4 Prüfungen am Tag 1 verabreicht. Für diese Studien ist eine deutliche schwarz-weiße Fahne in der Mitte der Plattform platziert, so dass die Flucht Standort liegt auf der Hand, um die Tiere. Zur Minimierung der Nutzung von Geodaten in dieser Phase sind an der Wand Signale entfernt und die Plattform und starten Standorte sind von Versuch zu Versuch unterschiedlich. Diese Phase hilft auszuschließen sensorisch-motorische-Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen vor der Übernahme beginnt. Für alle Phasen des MWM Aufgabe werden die Tiere unter den Vorderbeinen gehalten und sanft in das Wasser an den dafür vorgesehenen Startposition gesetzt, dem Gesicht zur Wand auf den Pool. Die Tiere sind in Kohorten von 8, so dass es eine 8 bis 10 Minuten inter-Studie Intervall zwischen jedem der 4 täglichen Studien getestet. Während der inter-Studie Abständen werden die Tiere in Käfigen Erwärmung zu Unterkühlung zu vermeiden gehalten. Für die cued Test wird eine maximale Schwimmzeit von 30 Sekunden für das Tier darf auf den AufstiegPlattform. Wenn die maximale Zeit, bevor das Tier flüchtet erreicht ist, führt der Experimentator es auf die Plattform von Hand und legt sie auf die Plattform. Das Tier bleibt auf der Plattform für eine Ruhezeit von 20 Sekunden, bevor sie in eine wärmende Käfig gesetzt. Für jede cued Test-Studie ist das Tier aus einer anderen, vorgegebenen Startpunkt auf den Umfang des Pools begonnen, und die Plattform ist auch für jeden der 4 verschiedenen Quadranten Positionen verschoben. Die Übernahme-Phase beginnt am folgenden Tag und besteht aus 4 Prüfungen pro Tag an 5 aufeinander folgenden Tagen. Während dieser Phase bleibt die versteckte Plattform an der gleichen Stelle und Tiere lernen, um dorthin zu navigieren mit dem distalen Zimmer Cues. Auch für jeden der 4 Studien, ist das Tier in den Pool an einer anderen, vorgegebenen Startpunkt platziert. Jeden Tag sind zwei der Startpunkte auf der linken Seite und zwei der Startpunkte sind auf der rechten Seite der Plattform, in zufälliger Reihenfolge, um die Entwicklung von egoc vermeidenentric räumliche Strategien, um die Aufgabe zu lösen. Die maximale Schwimmzeit für jeden Erwerb Studie beträgt 60 Sekunden, nach denen das Tier geführt wird und auf der Plattform durch den Experimentator. Das Tier bleibt auf der Plattform für 20 Sekunden folgende entkommen. Am Tag 7, 24 Stunden nach dem letzten Training Studie ist ein 60-Sekunden-Sonde Studie verabreicht, in denen die Plattform entfernt wird. Diese Phase bestimmt das Tier die Präferenz für den Quadranten, die auf der Plattform enthalten, verwendet und ist als Maß für die räumliche Referenz-Speicher 10 verwendet. Im Anschluss an die Sonde Versuch, die Plattform ist es, die gleichen Quadranten und 3 regelmäßigen Erwerb Studien kehrte verabreicht werden. Für die Umkehrung Lernen Test am Tag 8, ist die Plattform an eine neue Position bewegt, um Umkehr Lernfähigkeit beurteilen. Die Messung der Menge an Zeit Tiere verbringen die Suche nach der Plattform in seiner vorherigen Position im Vergleich zu seinem neuen Standort bietet eine Beurteilung der Perseveration, oder die inakeit zu unterdrücken als Reaktion auf die vorherige Position, sobald die Plattform wurde 10 bewegt. Da für den Erwerb und die Sonde Phasen, 4 60-Sekunden-Studien verabreicht. Für die cued Test werden Latenz zur Plattform und Geschwindigkeit zu finden als Maß der visuellen und motorischen Funktion, bzw.. Die Unterschiede zwischen den experimentellen Gruppen in dieser Phase müssen in Auslegung des Erwerbs und der Speicher Ergebnisse als Unterschiede in der sensorisch-motorischen Funktion zwischen den Gruppen bestehen können getroffen werden. Für den Erwerb Phase, mittlere Latenzzeit zu finden, die Plattform und / oder Weglänge dienen als Maß der räumlichen Lernen verwendet. In normalen Tieren, Flucht-Latenz verringert allmählich über die fünf Tage wie Akquisition, dass meine Flucht Zeit um 15 bis 20 Sekunden auf Tag 5 (Abb. 5A) ist. Für die Sonde Phase, mittlere Entfernung zur Plattform (Abb. 5B) und / oder Latenz zum ersten Reichweite der Plattform bisherigen Standort (Abb. 5C </strong>) dienen als Maß der Raumbezug Speicher verwendet. Für die Umkehrung Phase verbrachte Prozent der Zeit in alt gegen neu Quadranten mit der Plattform als Maß für die Perseveration verwendet wird. In den vier Studien sollten Vorliebe für die alte Plattform Standort abnehmen Vorliebe für die neue Plattform Standort etabliert ist (Abb. 5D). 5. Repräsentative Ergebnisse: Abbildung 1. Schematische Darstellung der kognitiven Tests Paradigmen. Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse aus Kontroll-Tieren auf dem Roman statt Anerkennung Aufgabe. A) Total time erkundschaften wir die zwei räumlichen Positionen sollten etwa gleich während der Einarbeitungsphase. B) Exploration Verhältnis (Zeit erforschen neuartige position / Zeit erkunden beide Positionen) zeigt eine klare Präferenz für den Roman räumliche Lage nach der 5-Minuten-und 24-stündiger Verspätung Abständen. Die gestrichelte Linie zeigt Chance Leistung. Abbildung 3. Repräsentative Ergebnisse aus Kontroll-Tieren auf dem erhöhten Plus-Labyrinth. Normale Tiere verbringen weniger Zeit, als durch Zufall in die offenen Arme (angedeutet durch die gestrichelte Linie) erwartet. Ängstliche Tiere verbringen anteilig weniger Zeit in die offenen Arme im Vergleich zur Kontrollgruppe, während mehrere Belichtungen, um das Labyrinth oder die Behandlung mit Anxiolytika Zeit in den offenen Armen verbracht erhöhen. Abbildung 4. Repräsentative Ergebnisse aus Kontroll-Tieren auf der Angstkonditionierung Aufgabe. Niedrige Konzentrationen des Einfrierens sind bei der ersten Exposition gegenüber der Kammer (Baseline beobachtet), Und wenn der Kontext ist, bevor die Cue-Test (pre-cue-Test) verändert. Im Gegensatz dazu verbringen normalen Tieren die meisten post-Ausbildung in Gefrierpunkt Verhalten beschäftigt. Wenn die Tiere den Kontext, in die Ausbildung nach einer 24-Stunden-Verspätung eingetreten erinnern, werden sie in dem Gefrierpunkt Verhalten für ca. 70% der 5-Minuten-Rahmen-Studie zu engagieren. Auch wenn die Tiere den Ton erinnern, zeigen sie ein hohes Maß an Frost während der Cue-und post-Cue-Test. Abbildung 5. Repräsentative Ergebnisse aus Kontroll-Tieren auf dem Morris Water Maze Aufgabe. A) Escape-Latenz verringert sich mit fortschreitendem Training während der Akquisitionsphase. B) und C) Mittlere Entfernung vom und Latenz zum ersten Kreuz die vorherige Plattform Lage während der 24-Stunden-Probe-Test dienen als Maß der Raumbezug Speicher verwendet. D) Reversal Learning wird durch Veränderung der Position der Plattform am letzten Tag des tes beurteiltting. In den 4 Studien, normale Tiere allmählich aufhören zu suchen, die alte Quadranten und erfahren, dass die Plattform in einen neuen Standort ist.