טכנולוגיה IgY: הפקת נוגדנים מן עוף חלמון ביצה על ידי פוליאתילן גליקול (PEG) רטיבות
Summary
פרוטוקול זה מתאר מיצוי מסוים של IgY הכולל חלמון ביצה באמצעות משקעים פוליאתילן גליקול ונותן מידע כללי על טכנולוגיה IgY.
Abstract
תרנגולות ניתן לחסן באמצעות החיסון im (שריר הפקטוראלי, שמאל וימין, נפח הזרקה 0.5-1.0 מ"ל) או באמצעות חיסון פלסמיד-Gene-Gun. תלוי immunogenicity של האנטיגן, גבוה נוגדנים titres (עד 1:100,000 – 1:1,000,000) יכולה להיות מושגת רק אחרי אחת או 3-4 חיסונים דחיפה. בדרך כלל, תרנגולת מטילה ביצים ברציפות במשך כ -72 שבועות, לאחר מכן פוחתת יכולת הנחת. פרוטוקול זה מתאר את החילוץ של IgY הכולל חלמון ביצה באמצעות הליך משקעים (PEG. Polson et al. 1980). השיטה כוללת שני צעדים חשובים. הראשון הוא הסרת שומנים והשני הוא משקעים של IgY הכולל supernatant של צעד אחד. אחרי דיאליזה נגד חיץ (בדרך כלל PBS) IgY-לחלץ ניתן לאחסן -20 מעלות צלזיוס למשך יותר משנה. טוהר לחלץ הוא סביב 80%, את סך IgY לביצה נע בין 40-80 מ"ג, תלוי בגיל תרנגולת הנחת. תוכן הכולל IgY עולה עם הגיל של התרנגולת מן סביב 40 מ"ג / ביצה עד 80 מ"ג / ביצה (ביחס PEG המשקעים). יכולת הנחת תרנגולת בשנה הוא כ 325 ביצים. כלומר, פוטנציאל יבול כולל של IgY גרם 20 שנה בסך הכל / מבוסס על תוכן IgY ממוצע של ביצה 60 מ"ג סה"כ IgY / (ראה לוח 1).
Protocol
Discussion
הבחירה של שיטת IgY מתאים טיהור מושפעת סולם של היטהרות (מעבדה או תעשייה), עלות יעילות, טכנולוגיה (ציוד מעבדה), ואת ההשפעה על הסביבה (ניהול פסולת). שיטות שונות להפקת IgY נסקרו בהרחבה על ידי דה Meulenaer & Huyghebaert (2001, לבדיקה לראות גם שאדה et al. 2005). באופן כללי, השיטות הללו ניתן לחלק לשלוש קבוצות עיקריות:
- שיטות רטיבות: מעורבים אמוניום או נתרן סולפט, polyethyleneglycol (PEG), חומצה caprylic ו caragenean.
- שיטות chromatographic: זיקה כרומטוגרפיה, כרומטוגרפיה מחליפי יונים, כרומטוגרפיה אינטראקציה הידרופובי, כרומטוגרפיה אינטראקציה thiophylic, ואת ג'ל סינון כרומטוגרפיה.
- Ultrafiltration.
טוהר הכנה IgY יכול להיות מוגברת על ידי שילוב של שיטות, למשל, PEG משקעים ניתן לשלב עם זיקה כרומטוגרפיה. במקרים מסוימים, בהתאם ליישום הסופי, תמצית של מים IgY מספיקה כדי להשיג תוצאות טובות (אקיטה & Nakai 1993). על פי הניסיון שלנו, IgY-מדגם נקבל על ידי PEG-משקעים עבד טוב מאוד בהרבה מבחני החיסונית שונים. על ידי סטנדרטיזציה בשיטת PEG-משקעים עוזר אחד טכני הוא מסוגל לעבד כ 84 ביצים בשבוע, אשר מתאים בסכום של IgY הכולל בין 4 ל 7 גרם בשבוע. חישוב פשוט: הנחת תרנגולת הוא מחוסן עם אנטיגן. לאחר חיסונים להגביר כמה תרנגולת מייצר נוגדנים ספציפיים (AB) עם titre של 1:50,000, במשך תקופה של 30 ימים. 30 ביצים x 2 מ"ל IgY לחלץ (ראה פרוטוקול איור. 3) מתאים IgY 60 מ"ל הכולל, אשר בתורו המתאים דילול Ab-l של 3000 (את הקיבולת של הדלי הוא 10 ליטר), זה אומר עם אני 3000 הפתרון Ab 300 דליים יכול להיות מלא. לכן, לאור כמות כזו Ab-עצום אין בעיה לאחסן Ab-הבריכה של איכות סגוליות מתמיד. טכניקה זו מפחיתה את השתנות תשלום / הרבה נצפתה אחרת polyspecific Ab.
למרות ההיבט של כמות, IgY Ab יש יתרונות נוספים בהשוואה IgG יונקים: אין הפעלה של מערכת המשלים יונקים, לא תגובתיות צולבת עם HAMA (עכבר אנושי נוגדנים נגד), גורמים שגרונית או אדם קבוצה דם אנטיגנים (חוסר heteroagglutinins).
היתרון הבולט של IgY-Ab הוא המרחק שנקרא פילוגנטי. מרחק פילוגנטי הסיבה להבדלים המתואר לעתים קרובות בין ספציפיות Ab של יונקים ועופות, גם כאשר שחוסנו זהה. בנוסף ההבדלים בין יונקים את המערכת החיסונית העופות עצמם, הבדלים בפיתוח פילוגנטי אלה שני מעמדות בעלי חיים תורמת ספציפיות שונות Ab. מחברים אחדים דיווחו כי לעתים קרובות לייצר תרנגולות Abs נגד מבחינה פילוגנטית יונקים חלבונים או פפטידים שמור ביותר ביעילות רבה יותר מאשר לעשות ארנבים (לבדיקה לראות שאדה et א 2005). כתוצאה מכך, נשמרת אנטיגן יכול להישאר "רעולי פנים" למערכת החיסון ארנב, ובכך לגרום רק חלש או תגובה "שקט". יתר על כן, אם תרנגולות וארנבות הם שחוסנו עם האנטיגן יונקים אותו, לעתים קרובות התרנגולות להגיב עם סגוליות-Ab זה יכול להיות מושגת רק לעתים נדירות ארנבים. גם את ההיבט של רווחת בעלי חיים חשוב מאז Ab הם הלא פולשני מופק חלמון ביצה. בשילוב עם חיסון (הפלסמיד) Gene-Gun IgY הייצור הוא לגמרי לא פולשנית (ויטקובסקי et al. 2009).
לסיכום, את הייצור של Ab ב התרנגולות ואת IgY-מיצוי באמצעים של PEG-המשקעים היא מאוד חסכונית תוצאות Ab מאוד ספציפיות עם titres יציב עד 1:1,000,000. בשל המרחק בין פילוגנטי Aves ו יונקים, עופות מסוגלים לייצר Ab ספציפיים נגד אנטיגנים יונקים שמור ביותר לעומת ארנבים למשל. כמות יוצאת דופן של Ab מתקבל על ידי IgY הטכנולוגיה פותח את הדלת גם עבור שימוש IgY-Ab ברפואה אדם ולשימוש וטרינרי למטרות טיפוליות / מניעתי.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם המשרד הפדרלי הגרמני לחינוך ולמחקר (פרויקט BiGRUDI [Bi ologische G efahrenlagen: R isikobewertung, u ltraschnelle D etektion und אני dentifizierung פון bioterroristisch relevanten Agenzien, 13N9594]). אנו מודים ב Diemar (Charité-Universitätsmedizin ברלין, Institut für Pharmakologie) לקבלת סיוע טכני מעולה.
Materials
- Dialyse Bag Visking, Type 27/32, cut off -14 kD, Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany
- Falcon tubes Blue Max, 50 ml Polypropylene Conical Tube, Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes NY, USA
- Folded Filter MN 615 ¼, ∅ 150 mm, Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany Heraeus
- Magnetic stirrer, Variomag Mono, H+P Labortechnik AG, Oberschleißheim, Germany
- Micro-Dialyse-Capsule 5,0 ml, Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany
- Multifuge 3SR+, Thermo Scientific, Langenselbold, Germany
- Photometer UV-160A, Shimadzu Deutschland GmbH, Duisburg, Germany
- Polyethylene Glycol 6000, Rotipuran Ph. Eur., Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany
- Premixed PBS-Buffer 10x, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany
- Roller Mixer SRT2, Stuart, Staffordshire, UK
- Vibrofix VF2, Janke & Kunkel, IKA-Labortechnik, Staufen i.Br., Germany
- Yolk spoon, Fackelmann (houshold effects), Germany
References
- Akita, E. M., Nakai, S. Comparison of four purification methods for the production of immunoglobulins from eggs laid by hens immunized with an enterotoxigenic E. coli strain. J. Immunol. Methods. 160, 207-214 (1993).
- De Meulenaer, B., Huyghebaert, A. Isolation and purification of chicken egg yolk immunoglobulins: a review. Food Agricult. Immunol. 13, 275-288 (2001).
- Klimentzou, P., Paravatou-Petsotas, M., Zikos, C. h., Beck, A., Skopeliti, M., Czarnecki, J., Tsitsilonis, O., Voelter, W., Livaniou, E., Evangelatos, G. P. Development and immunochemical evaluation of antibodies Y for the poorly, immunogenic polypeptide prothymosin alpha. Peptides. 27, 183-193 (2006).
- Pauly, D., Dorner, M., Zhang, X., Hlinak, A., Dorner, B., Schade, R. Monitoring of laying capacity, immunoglobulin Y concentration, and antibody titer development in chickens immunized with ricin and botulinum toxins over a two-year period. Poultry Science. 88, 281-290 (2009).
- Polson, A., von Wechmar, M. B., van Regenmortel, M. H. Isolation of viral IgY antibodies from yolks of immunized hens. Immunol. Commun. 9, 475-493 (1980).
- Schade, R., Behn, I., Erhard, M., Hlinak, A., Staak, C. . Chicken egg yolk antibodies, production and application : IgY-Technology. , (2001).
- Schade, R., Calzado, E. G., Sarmiento, R., Chacana, P. A., Porankiewicz-Asplund, J., Terzolo, H. R. Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): a review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine. Altern. Lab Anim. 33, 129-154 (2005).
- Witkowski, P. T., Bourquain, D. R., Hohn, O., Schade, R., Nitsche, A. Gene gun-supported DNA immunisation of chicken for straightforward production of poxvirus-specifiv IgY antibodies. J. Immunol. Methods. 341, 146-153 (2009).
