Rat Mesenterium Angiogenese Assay

1. Animals Kleine Nagetiere wie Ratten, Mäuse und Meerschweinchen haben als Tiermodelle verwendet worden. Leider neigen erwachsenen Mäusen (viele Mausstämme wurden bewertet), um fehlende oder nur eine sehr geringe Anzahl von potenziellen Elternteil Mikrogefäßen (von denen die Angiogenese entstehen können) innerhalb ihrer mesenterialen Fenster, was Studien mit Mäusen unzuverlässig. Deshalb hat der Test vor allem für Ratten entwickelt. Die Ratten, die zu einer Standard-Umgebung für mindestens 7 Tage nach Auslieferung vom Züchter sind akklimatisiert, sind in der Regel paarweise in einem Standard-Käfig untergebracht unter einem 12-Stunden Licht / Dunkel-Zyklus mit freiem Zugang zu Wasser und Pellets. Jedes Tier ist markiert. Wir verwenden meist jungen erwachsenen Ratten (in der Regel 7-10 Wochen alt verschiedener Stämme aber in der Regel männlichen Sprague-Dawley Ratten; bei Ratten jünger als 5-6 Wochen im Alter von der Zahl der einheimischen Mikrogefäßen eher gering zu sein) aus verschiedenen Züchtern erhalten. In der Zeit vor dem Experiment und während des Experiments werden die Tiere gewogen jeden zweiten Tag, und immer am Tag des Opfers. Wenn die Tiere behandelt werden, gleichzeitig ip (für die Induktion der Angiogenese, siehe unten) und sc oder iv oder po, sie werden gewogen jeden Tag. Dies ermöglicht die Einrichtung von Versuchs-und Kontrollgruppen gleich Körpergewicht zu Beginn des Experiments, und erlaubt die Überwachung der Einfluss der Behandlung auf Körper-weight-gain im Verlauf des Experiments. Da erwachsenen männlichen Ratten robust wachsen physiologisch (Gewinnung etwa 40-60 g pro Woche, je nach Art der Belastung), ist Gewichtszunahme Retardierung ein sensibles Ersatz-Marker der Toxizität, systemische Wohlbefinden, Appetitlosigkeit und Gedeihstörungen. Wir arbeiten in einem High-Standard-Tierstation und erhebliche Anstrengungen unternommen werden, um die Höhe der Belastung durch die Tiere erlebt zu minimieren. Die aktuellen ethischen Richtlinien sind die von Workman P. et al. (Richtlinien für das Wohlergehen und die Verwendung von Tieren in der Krebsforschung. Br. J. Cancer 102, 1555-77, 2010). The Animal Ethikkommission der Universität Göteborg genehmigt diese Studien. 2. Pro-angiogenen intraperitoneale Behandlung Der Kandidat pro-angiogenen Faktor getestet werden gelöst und verdünnt in die Endotoxin-freie Kochsalzlösung zur Infusion von Patienten verwendet werden (auch bei extrem niedrigen Niveau, ist die Endotoxin-pro-angiogenen). Alle Lösungen sind bis frisch am Tag der Injektion, sterilfiltriert (Millipore 0,22-um Filtration) gemacht, geprüft neutralen pH-Wert (7.1-7.3), und verwendet bei Raumtemperatur. Der Test-Agent wird bei niedrigen oder sehr niedrigen Konzentrationen injiziert. Zum Beispiel, Ratte rVEGF 164 (564-RV/CF; R & D Systems Europe, Ltd, Oxon, UK) ist, die die vorherrschende VEGF-A-Isoform bei Ratten ist, auf 96 pmol / ml in Endotoxin-freie Kochsalzlösung verdünnt, gefroren und aufgetaut und einem Volumen von 5 ml injiziert ip in der Ratte. Wir verwenden eine 5-ml-Spritze mit 0,8-mm-Nadel (grüne Nadel, 21G) für ip-Injektion. Diese Behandlung, zweimal täglich über 4,5 Tage, dh. Gegeben, von Montag Morgen (Tag 0) bis Freitagmorgen (Tag 4), führt zu einem robusten sprießen Angiogenese Reaktion in den mesenterialen Test Gewebe mit einem Spitzenwert von rund Day 21. Die Verwaltung der Lösung ip sorgt dafür, dass das gesamte Volumen in die Bauchhöhle (und nicht in den Darm, Blase oder jedes andere Organ) geliefert wird. Die schnelle Injektion von 5 ml ermöglicht taktile Bestätigung durch den Betreiber, dass der Flüssigkeitsstrahl hat durch die Bauchdecke in die Bauchhöhle geleitet. Nach, vor oder gleichzeitig mit der IP-pro-angiogenen Therapie kann jeder testen Mittel der Wahl systemisch verabreicht werden. 3. Systemische Administation der Angiogenese-modulierenden Agents Jede Route anderes als die ip route kann verwendet werden, da ip Behandlung der laufenden angiogenen Reaktion durch die Induktion der Entzündung oder möglicherweise durch die Aktivierung der Mastzellen im Test Gewebe, was zu einer starken pro-angiogene Reaktion führen kann beeinflussen können. Neben oralen Verabreichung oder einzelne Injektion sc oder iv, benutzen wir oft sc Verabreichung mit osmotische Minipumpen (eine oder mehrere, mit unterschiedlichen Volumina und Pumpzeiten) zu der Lösung mit einer konstanten Rate von bis zu liefern, um zwei oder mehrere Wochen. Die kontinuierliche subkutane Infusion von Test-Agenten Abfüll-und Implantation von osmotischen Minipumpen In der Regel an Tag 5, also einen Tag nach dem Ende der ip Behandlung mit VEGF, osmotische Minipumpen (z. B. Modell 2ML2, mit konstanter Pumprate von 5,0 ul / h für 14-15 Tage; Alzet osmotische Pumpen, Mountain View, CA , USA) werden unter sterilen Bedingungen mit dem Test-Agent oder das passende Fahrzeug gefüllt. Nach der Lagerung in 0,9% (w / v) NaCl über Nacht bei 37 ° C, die Pumpe (n) werden chirurgisch sc auf dem Rücken implantiert (an der Seite des Rückenmarks Column in den Bereich der Schulterblätter) von Ratten, die betäubt wurden mit Isofluran-Gas (Isoba Tierarzt; Schering-Plough Animal Health, Merck & Co., Inc., Whitehouse Station, NJ, USA), zunächst in einer luftdichten Kammer und transparent anschließend über eine Maske (um den Stress verursacht die folgenden Tier zu minimieren, wird die Kammer mit Luft gespült, bevor sie wiederverwendet wird). Der Hautschnitt für Pumpe Implantation gemacht wird vernäht sofort nach der Implantation mit seidenen Faden. Da die Tiere an Gewicht zunehmen physiologisch während der experimentellen Phase und der Test-Agenten sind mit einer konstanten Rate verabreicht wird, ist die tatsächliche Dosis für einen Test Droge pro kg Körpergewicht höher gewählt werden als die durchschnittliche Dosierung zu Beginn der Infusion und niedriger als der durchschnittliche Dosis am Ende der Infusion. Kontinuierliche Infusion, wie hier beschrieben, kann als eine erweiterte Form der metronomischer Behandlung angesehen werden. 4. Beenden des Experiment Ein Tier zu einer Zeit, in einem transparenten luftdichten Kammer, die mit CO 2-Gas, die sich schnell tötet das Tier gespült platziert wird. Die Kammer ist mit Luft, bevor sie wieder verwendet werden gespült. 5. Harvesting Gewebeproben Wie in der DVD gezeigt, ist die Bauchdecke geöffnet und die kleinen Darm Mesenterium identifiziert, darunter die meisten distalen Teil, dass die Ileocoecalklappe (der Kreuzung der Dünndarm und den Dickdarm) erreicht. Vier (oder mehr) der distal gelegen "Fenster" sind gezählt und die Ausbreitung auf objektiven Maßstab unbehandelten Superfrost Plus-Objektträger (DAKO Denmark A / S, Glostrup, Dänemark). Es ist wichtig, um zu vermeiden, wenn möglich, Kontamination der Proben mit Blut, Darminhalt oder anderen Körperflüssigkeiten, da diese Materialien können gebeizt unspezifisch, obwohl dies nicht die Unwirksamkeit nicht die anschließende immunhistochemische Visualisierung von Mikrogefäßen. Jeder mesenterialen Fenster Probe mit angeschlossenem kleinen Darm-Segment befindet sich auf einem Objektträger ausgestrichen und getrocknet bei Raumtemperatur für 20 Minuten. Dann wird der Darm Stumpf abgeschnitten, während die intakte membranöse Mesenterium Proben bei -20 ° C über einen längeren Zeitraum gespeichert werden. Dies wird in der DVD gezeigt. Es sollte erwähnt werden, dass das Gewebe und zum Patent Gefäßsystem visualisiert werden können, bevor sie mit Durchlicht Intravitalmikroskopie Ernte. 6. Protokoll für die immunhistochemische Färbung von Mikrogefäßen Tag 0 Die Proben dürfen von -20 ° C bis Raumtemperatur, in einem Schrank bei 60 ° C getrocknet 1 Stunde auftauen und hielt über Nacht bei Raumtemperatur. Tag 1 Legen Sie die Folien in Färbung Objektträgerhalter (in jeder zweiten Spur) in einer Küvette und waschen zweimal mit TBS (pH 7,8) für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Die Lösung wird verworfen und durch die nächste Lösung, und so weiter für alle folgenden Schritte. Trypsin-Behandlung Füllen Sie die Küvette, dass die Färbung Diahalter mit Trypsin-Lösung (25 ° C für 20 Minuten) wird den Hafen. Entsorgen Sie die Lösung, Inkubation zweimal mit 2,5% Saccharose-Lösung (Raumtemperatur für jeweils 10 Minuten Zeit). Entsorgen Sie die Lösung und spülen Sie ein paar Mal in aqua dest (Raumtemperatur für ein paar Minuten). Sperrung Füllen Sie die Küvette, dass die Färbung Diahalter mit 0,5% H 2 O 2 in Methanol (Raumtemperatur 30 Minuten) wird den Hafen. Entsorgen Sie die Lösung und spülen mit Aqua dest (Raumtemperatur für ein paar Minuten). Entsorgen Sie die Lösung und spülen Sie zweimal mit TBS (pH 7,4) (Raumtemperatur für 8 Minuten jedes Mal). Incubation Alle Inkubationen werden in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur. Etwa 150 ul jeder der aufgeführten Lösungen sind pro Folie verwendet. Die Folien sind in einer feuchten Kammer gelegt und die Lösungen sind auf die Proben (nicht-membranöse Teile müssen nicht durch die Lösungen abgedeckt werden) pipettiert. Für jede der folgenden Schritte sorgfältig abschütteln alle der Lösung vor der anschließenden Lösung versetzt. Inkubation mit Normal (Blockierung) im Serum (Pferd) (ABC-Kit) 3 Tropfen gelbe Lösung / 10 ml Verdünnungspuffer für 20 Minuten. Inkubation mit primärem Antikörper ARU0181, die Ratte vaskulären Endothelzellen Etiketten. Der Antikörper wird 1:600 ​​mit Verdünnungspuffer (Biosource) (100 ul verdünnt 40-fach [gefrorenen] plus 900 ul Verdünnungspuffer) und Inkubation verdünnt erfolgt über Nacht bei 4 ° C. Tag 2 Die Folien aus der feuchten Kammer entfernt werden, wird der primäre Antikörper verworfen, und die Folien sind in einer Färbung Diahalter, die in der Küvette eingetaucht ist und zweimal mit TBS gespült platziert(PH 7,8) für 8 Minuten. Inkubation mit biotinylierten Antikörper (ABC-Kit) Die Folien sind horizontal in einer befeuchteten Kammer platziert und mit 1 Tropfen blaue Lösung / 10 ml Verdünnungspuffer für 30 Minuten. Entsorgen Sie die Lösung und Objektträger in eine Färbung Diahalter in die Küvette eingetaucht und gründlich zweimal mit TBS (pH 7,4) für 8 Minuten. Die Inkubation mit dem ABC-Reagenz Die Folien sind wieder horizontal in einer befeuchteten Kammer platziert und die folgenden Lösungen sind auf die membranöse Teile der Proben pipettiert: 2 Tropfen orange Lösung plus 2 Tropfen braune Lösung / 10 ml TBS (pH 7,4) für 30 Minuten. Vorsichtig mischen 30 Minuten vor Gebrauch! Entsorgen Sie die Lösung und Objektträger in den Diahalter in die Küvette und spülen Sie zweimal mit TBS (pH 7,4) für 8 Minuten. Färbung mit DAB (0,05%) Dieser Schritt muss in einem gut belüfteten chemische Abzug durchgeführt werden! Legen Sie die Folien und fügen Sie die 3,3-Diaminobenzidin (DAB, Sigma-Aldrich)-Lösung mit einer Pipette: 0,1% DAB-Lösung in TBS (pH 7,4) [gefrorenen] ist 1:1 mit einem Gemisch aus 10 ul H 2 O verdünnt 2 und 7,5 ml TBS (pH 7,4). Diese Lösung wird sterilfiltriert unmittelbar vor Gebrauch (um Partikel, die das mikroskopische Bild verdunkeln, zu beseitigen). Stain die Proben für 8 Minuten. Entsorgen Sie die Lösung und Objektträger in der Färbung Diahalter in die Küvette getaucht. Spülen unter fließendem Leitungswasser und dann in Aqua dest für ein paar Minuten. Austrocknung Die Folien sind in der Färbung Diahalter gehalten. Spülen durch das Wegwerfen und Nachfüllen der Küvette mit aqua dest / Ethanol: aqua dest, 70% Alkohol, 95% Alkohol, absolutem Alkohol, mit 2 Minuten in jeder Lösung. 7. Imaging und Beurteilung der mikrovaskulären Netzwerk in jedem Mesenteriale Fenster Probe nach der immunhistochemische Färbung von vaskulären Endothelzellen Wie im Film gezeigt werden Mikrogefäßen mikroskopisch visualisiert in situ in das intakte Gewebe. Erstens verwenden wir eine Zeichnung Mikroskop mit Vergrößerungsbereich 14 bis 34 (Leica Wilde M 3Z) zu Bleistift auf weißem Papier die gesamte Fensterfläche, sowie die gesamte vaskularisierten Bereich (VA) pro mesenterialen Fenster. VA, als Prozentsatz der gesamten Fläche ist leicht gemessen anhand elektronischer oder nicht-automatisiert Planimetrie (oder einfach durch Ausschneiden und Gewichtung des Bildes des gesamten Fensters, und die Bilder von allen vaskularisierten Teile). Mit einer anderen Zeichnung Mikroskop einzelne microvessel Profile, die leicht erkennbar sind, werden in schwarzer Tinte auf weißem Papier bei 80 Vergrößerung in zufällig ausgewählten Bereichen gezogen. Dies ist der Ausgangspunkt für die nachfolgende computergestützte morphometrische Beurteilung der mikrovaskulären Länge (MVL), die im Grunde eine Messung der mikrovaskulären Dichte. Optional Variablen in Bezug auf mikrovaskuläre Musterbildung, können ebenso wie die für die Beurteilung der Anzahl der mikrovaskulären Sprossen und Länge der einzelnen mikrovaskuläre Sprossen (Nr. SP und Le. SP bezeichnet) ermittelt werden. -Der optimale Kontrast zwischen der abgebildeten schwarzen Gefäßstrukturen und den weißen Hintergrund ermöglicht detaillierte Analysen der Bilder in den meisten kommerziellen morphometrische EDV-Programme. In den meisten Fällen sind die wichtigsten Variablen VA und MVL, die, wenn miteinander multipliziert erzeugen die insgesamt mikrovaskuläre Länge (TMVL). 8. Statistische Analyse Wir verwenden normalerweise den Standard nicht-parametrischen Mann-Whitney-U-Test zu ungepaarten (zweiseitig) Beobachtungen zu analysieren. Ein Mittelwert von vier mesenterialen Fenster pro Tier wird als unabhängige Daten-Punkt für jede Variable der mesenterialen Fenster verwendet. Das Kriterium für die statistische Signifikanz P ≤ 0,05.