ヒトのインビトロ抑制
Summary
Tregsのは、免疫系の強力な抑制因子である。それ故に、それらを定義するためにユニークな表面マーカーの欠如が存在する、Tregsのの定義は、主に機能的です。ここでは、最適化を説明<em> in vitroで</emT1D開発するリスクのある被験者において免疫不均衡を識別することができる>アッセイ。
Abstract
制御性T細胞（Treg）は自己抗原に対する免疫寛容の重要なメディエーターである。さらに、彼らは感染後の免疫応答の重要な調節因子である。 Tregsの上でユニークな表面マーカーを同定するための努力にもかかわらず、唯一のユニークな特徴は、エフェクターT細胞の増殖や機能を抑制する能力です。それが唯一のin vitroアッセイにおいてヒトTregの機能を評価に使用される場合があることは明らかですが健康な細胞と細胞（1型糖尿- T1Dのような）自己免疫疾患を有する被験者から分離された横断的研究からの結果を評価する際に、これは問題となる必 要があります。比較する。応答者の比率とのin vitro抑制アッセイにおけるヒトで使用されている抗原提示細胞（APC）の数と種類：レスポンダーT細胞、刺激の性質と強さ、Tregの数と種類の研究所の間で大きなばらつきがあります。この変動は、困難なTregの機能を測定する研究間の比較を行います。 Tregのフィールドには、健常者と自己免疫疾患患者の両方でうまく動作する標準化された抑制アッセイを必要とします。我々は、膵β細胞の自己免疫破壊の根底にあるの被験者に比べて健康なボランティアから単離したT細胞の刺激ではほとんどのイントラアッセイのばらつきを示すin vitroでの抑制アッセイで開発した。この作品の主な目的は、異なる被験者グループ間の比較を可能にするin vitroでヒトの抑制アッセイで記述することです。さらに、このアッセイは、このように予防的免疫療法の1から利益を得ることができる科目を識別する、機能をnTregに小さな損失を描くと、将来のさらなる損失を予測する可能性を秘めています。以下、我々は、この手順に必要な手順の徹底的な説明を提供しています。我々はTregの機能を測定するために使用されるin vitroでの抑制アッセイの標準化に貢献したいと考えています。さらに、我々は免疫不均衡の初期の状態とT1Dのための潜在的な機能のバイオマーカーを認識するツールとして、このアッセイを提供する。
Protocol
1。抑制アッセイを設定する前に、その後の細胞の刺激とするための抗ヒトCD3（クローンUCHT1、最終濃度1μg/mlの）でコーティングtosylactivatedビーズへの1つのニーズは、ビーズが効率的に人間を用いた in vitro増殖アッセイで設定することによって被覆されているかどうかを確認するT細胞オリジナルバイアル、磁気スタンドの場所からM – 450 tosylactivatedビーズを1mlを取り、す?…
Discussion
Tregsのへの唯一のユニークな特徴として、抑制機能は、同じ内および異なる研究間の疾患の開発のさまざまな段階での被験者の間で確実にかつ均一にテストする必要があります。我々は、このアッセイの標準化への貢献として、当研究室で開発抑制アッセイの詳細を提供します。私たちの広範な最適化の研究では、我々は自然の刺激を提供するAPCとしてPBMCとの併用で抗ヒトCD3でコーティング…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、ウィスコンシン州とウィスコンシン州の子どもの研究所の少年Diabetesat医科大学のマックスマギー国立研究センターによってサポートされていました。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析の役割、または原稿の準備がなかった。
Materials
| Name of the reagent or instrument | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Ficoll-Paque PLUS | Amersham Pharmacia Biotech | 17-1440-03 | |
| DPBS-1X | Gibco | 14190-144 | |
| Trypan Blue | Invitrogen | 15250-061 | |
| anti-CD4 microbeads | Miltenyi | 130-045-101 | |
| Pre-separation filters | Miltenyi | 130-041-407 | |
| LS column | Miltenyi | 130-042-401 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| Anti-human CD4-APCCy7 (clone RPA-T4) | BD Pharmingen | 557852 | |
| Anti-human CD25-PE (clone M-A251; IL-2Rα) | BD Pharmingen | 555432 | |
| Anti-human CD8-FITC (clone RPA-T8) | BD Pharmingen | 555366 | |
| Anti-human CD14-FITC (clone M5E2; LPS receptor) | BD Pharmingen | 555397 | |
| Anti-human CD32-FITC (clone FLI8.26; FcγR-type II) | BD Pharmingen | 555448 | |
| Anti-human CD116-FITC (clone M5D12; GM-CSFRα chain) | BD Pharmingen | 554532 | |
| Dynalbeads M-450 tosylactivated | Invitrogen | 140-13 | |
| Anti-human CD3 | Ancell | 144-024 | |
| Buffer1 | Homemade | 0.1M Na2B4O7 pH7.6 | |
| Buffer2 | Homemade | PBS/2mM EDTA/ 0.1% BSA pH7.4 | |
| Buffer3 | Homemade | 0.2M Tris/0.1% BSA pH8.5 | |
| Complete RPMI media | Homemade | RPMI 1640 media 2 mM L-glutamine 5 mM HEPES 100 U/μg/ml peni/strept 0.5 mM sodium pyruvate | |
| [3H] thymidine | Perkin Elmer | NET027Z005MC | |
| human pooled AB serum | Atlanta Biologicals | S40110 | |
| Multiscreen harvest plate | Millipore | MAHFC1H60 | |
| Microscint 20 | Perkin Elmer | 6013621 |
References
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Cite This Article
Waukau, J., Woodliff, J., Glisic, S. Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance. J. Vis. Exp. (53), e3071, doi:10.3791/3071 (2011).