التصور من الحمض النووي المؤتلف والمجمعات البروتين باستخدام الميكروسكوب القوة الذرية
Summary
ووصف التنصت وضع مجهر القوة الذرية (AFM) طريقة لتصور DNA البلازميد ، بروتينات حشوية ، والمجمعات الحمض النووي والبروتينات. الأسلوب يشمل النهج البديل لإعداد العينات للتصوير فؤاد التالية التلاعب البيوكيميائية. ويلاحظ والتي تحتوي على الحمض النووي محددة التفاعل البروتين المناطق العازلة في ظروف شبه فيزيولوجي.
Abstract
قوة ذرية المجهر (فؤاد) يسمح للتصور الفردي للبروتينات ، جزيئات الحمض النووي ، ومجمعات البروتين البروتين ، والمجمعات الحمض النووي والبروتينات. في نهاية ناتئ المجهر هو تحقيق نانو النطاق الذي يخترق المناطق صورة تتراوح بين نانومتر وميكرومتر ، وقياس الارتفاع من الجزيئات يستريح على سطح الركيزة في أي لحظة معينة. القوات الكهروستاتيكية تسبب البروتينات والدهون والأحماض النووية لإرفاق فضفاضة إلى الركيزة في التوجهات العشوائية والسماح التصوير. البيانات التي تم إنشاؤها تشبه الخريطة الطوبوغرافية ، حيث حل والجزيئات ثلاثية الأبعاد من أحجام الجسيمات منفصلة (الشكل 1) 1،2. التنصت وضع فؤاد ينطوي على التذبذب المتكرر للتعزية ، والذي يسمح التصوير من المواد الحيوية لينة نسبيا مثل الحمض النووي والبروتينات. واحدة من فوائد ملحوظة من فؤاد على غيرها من تقنيات النانو المجهري هو قدرتها على التكيف النسبي لتصور البروتينات الفردية والجزيئات في مجمعات المخازن المائية ، بما في ذلك شبه فيزيولوجي ظروف تخزينها مؤقتا ، في الوقت الحقيقي ، ودون تلوين أو طلاء العينة ليتم طباعتها.
الطريقة المعروضة هنا يصف التصوير من الحمض النووي وعامل النسخ immunoadsorbed (أي مستقبلات جلايكورتيكود ، GR) مخزنة في محلول (الشكل 2). ويمكن فصل البروتينات والمجمعات Immunoadsorbed البروتين من بيليه الأجسام المضادة immunoadsorbing حبة من روح التنافس مع الأجسام المضادة وحاتمة ثم التقط (الشكل 2A). وهذا يسمح للتلاعب البيوكيميائية من الجزيئات الحيوية التي تهم قبل التصوير. المنقى مرة واحدة ، يمكن أن تكون مختلطة الحمض النووي والبروتينات ويمكن تصوير مجمع التفاعل الناتجة كذلك. الربط من الحمض النووي لالميكا يتطلب الموجبة ثنائي التكافؤ 3 ، مثل Ni 2 + 2 + أو Mg ، والتي يمكن أن تضاف إلى مخازن العينة بعد الحفاظ على نشاط البروتين. باستخدام نهج مماثل ، وقد استخدمت لتصوير فؤاد الانزيمات الفردية ، بما في ذلك بوليميريز الحمض النووي الريبي (4) وانزيم تصليح 5 ، منضما إلى جدائل الحمض النووي الفردية. هذه التجارب تعطي تفسيرا واضحا في البروتين البروتين والحمض النووي والبروتينات البيوفيزيائية التفاعلات التي تحدث على المستوى الجزيئي. يمكن للجسيمات التصوير الجزيئات الفردية مع فؤاد مفيدا لتحديد الجسيمات التجانس ولتحديد الترتيب الفعلي للعناصر المكونة للجسيمات تصوير. بينما تم تطوير الطريقة الحالية لرؤية خيوط GR – البروتين والحمض النووي كوصي 1،2 المجمعات التي يمكن ربط الموارد الوراثية ، ويمكن تطبيقه على نطاق واسع لعينات الحمض النووي والتصوير والبروتين من مصادر متنوعة.
Protocol
Discussion
فؤاد يوفر تقنية فريدة من نوعها مجهرية قادرة على الجزيئات الحيوية الفردية غير المصقول في التصوير المائي وقرب حلول فيزيولوجي مخزنة في الوقت الحقيقي. وهذا يسمح للتصور من البروتينات الفردية وجزيئات الحمض النووي ، فضلا عن المجمعات والمجمعات multiprotein بالبروتين الحمض النووي. يمكن أن جزيئات الجزيئات التصوير مع فؤاد مفيدا لتقييم تجانس العينة وتحديد الترتيب الفعلي للعناصر المكونة للجسيمات ملاحظتها. ويمكن ملاحظة هذا النهج من جزيئات الجزيئات الفردية أن تكون إضافة مفيدة لتقنيات الكيمياء الحيوية التقليدية ، مثل فحوصات مناعي ، بولي أكريلاميد الكهربائي للهلام ، واللوني حجم العمود الاستبعاد ، والتي توفر بيانات تلخيصي كبيرة تمثل 10 3 11 -10 مجمعات الجزيئية البيولوجية لمصلحة فرد موجود في العينة.
يمكن لجميع البحوث في رياضيات الكيمياء متعدد البروتينات ، والتفاعلات الجزيئية البيولوجية ، ومتطلبات العامل المساعد يتم التحقيق باستخدام فؤاد. ويمكن تكييف الطريقة المعروضة هنا لاستيعاب الأسئلة البيوفيزيائية محددة من الفائدة. على سبيل المثال ، وذلك باستخدام مسبار خلية السائل حامل قادرة على تبادل العازلة ، فمن الممكن لمتطلبات الفحص العامل المساعد لتكوين البروتين المعقدة. يمكن تشكيل الحمض النووي والبروتينات وفصلها في التجمعات القريبة من الوقت الحقيقي ، وحتى في الوقت الذي يجري تصويره. يمكن توليد الحمض النووي مع تسلسل محدد من الفائدة (على سبيل المثال عناصر الاستجابة الظني ، أو رواية تسلسل البروتين ملزمة) ، مختلطة مع بروتين الربط الافتراض ، وتصوير لتقديم أدلة مباشرة على التفاعلات بين الجزيئات.
التنصت على وضع التصوير فؤاد هو الى حد كبير أقل تعقيدا إذا تستخدم العينات الجافة بدلا من العينات في المحاليل المائية ، وتقف على الحمض النووي DNA الخطية والبلازميدات دائرة مغلقة على حد سواء تم تصويره في هذا السبيل 3،9. الأسلوب المقدمة هنا تستخدم عينات مخزنة في الحلول من أجل توفير بيئة التصوير أكثر الفسيولوجية. وينبغي أيضا أساليب أخرى جديرة بالذكر من البروتينات التصوير النظر فيها ، بما في ذلك مجال الأشعة تحت الحمراء القريبة من المجهري 10. الاستخدام المتكامل للامتزاز مناعي في القرين مع فؤاد يوفر فرصة لإعداد مجموعة كبيرة من المجمعات البروتين ، وذلك باستخدام تقنيات راسخة البيوكيميائية ، وتصور لهم ثم بعد الإفراج عن بيليه الأجسام المضادة حبة immunoadsorbing. على سبيل المثال ، كان يعاير GR immunoadsorbed لارتباطه مع البروتين hsp70 كوصي الجزيئية (1) ، وكذلك البروتين السيارات داينين 2 باستخدام هذا النهج من أجل تقدير حجم التعقيد وstoichiometries. حجم الجسيمات وخصائص الفيزيائية الحيوية (مثل الصلابة) كانت مفيدة في التحقق من هوية الجزيئات الحيوية التي لوحظت في عينات من تصوير فؤاد 11،12. ومن الممكن أيضا لتأكيد الهوية جزيء حيوي عن طريق إضافة لجزيء حيوي التفاعل (مثل ليجند أو ريتوكسيماب) ، التي من شأنها ربط هدفها وتسبب زيادة حجم الجسيمات إذا كان الهدف هو جزيء حيوي الحالي.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة GM086822 المنحة. فإن الكتاب أود أن أشكر الدكاترة. أليك Pakhomov والاس بول (جامعة تقنية النانو واشنطن مرفق المستخدم (NTUF)) واندريا سليد (بروكر AXS) لما قدموه من مساعدة تقنية من الخبراء. وقد أجريت DNA فؤاد التصوير في جامعة. واشنطن NTUF ، وهو عضو في شبكة تقنية النانو البنية التحتية الوطنية. ويعود الفضل في البلازميد 2xGal4 – 2xGRE – luciferease من قبل المختبر الدكتور كيث ياماموتو (جامعة كاليفورنيا ، سان فرانسيسكو).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Dimension 3100 | Bruker | Dimension 3100 |
| Dimension Fluid Cell | Bruker | DTFML-DD-HE |
| Sharp nitride lever (SNL) silicon nitride AFM probe | Bruker | SNL-10 |
| Microlever sharp nitride lever (MSNL) silicon nitride AFM probe | Bruker | MSNL-10 |
| NanoScope AFM instrument software | Bruker | 004-132-000 |
| Metal AFM specimen discs | Ted Pella | 16208 |
| Grade V1 Mica Discs, 12 mm | Ted Pella | 50-12 |
References
- Murphy, P. J. M. Visualization and mechanism of assembly of a glucocorticoid receptor•hsp70 complex that is primed for subsequent Hsp90-dependent opening of the steroid binding cleft. J Biol Chem. 278, 34764-34773 (2003).
- Harrell, J. M. Evidence for glucocorticoid receptor transport on microtubules by dynein. J Biol Chem. 279, 54647-54654 (2004).
- Pastre, D. Adsorption of DNA to mica mediated by divalent counterions: a theoretical and experimental study. Biophys J. 85, 2507-2518 (2003).
- Guthold, M. Direct observation of one-dimensional diffusion and transcription by Escherichia coli RNA polymerase. Biophys J. 77, 2284-2294 (1999).
- Petrucco, S., Volpi, G., Bolchi, A., Rivetti, C., Ottonello, S. A nick-sensing DNA 3′-repair enzyme from Arabidopsis. J Biol Chem. 277, 23675-23683 (2002).
- Murphy, P. J. M., Morishima, Y., Kovacs, J. J., Yao, T. P., Pratt, W. B. Regulation of the dynamics of hsp90 action on the glucocorticoid receptor by acetylation/deacetylation of the chaperone. J Biol Chem. 280, 33792-33799 (2005).
- Ruan, B., Fisher, K. E., Alexander, P. A., Doroshko, V., Bryan, P. N. Engineering subtilisin into a fluoride-triggered processing protease useful for one-step protein purification. Biochemistry. 43, 14539-14546 (2004).
- Meijsing, S. H., Elbi, C., Luecke, H. F., Hager, G. L., Yamamoto, K. R. The ligand binding domain controls glucocorticoid receptor dynamics independent of ligand release. Mol Cell Biol. 27, 2442-2451 (2007).
- Shen, X. C. A simple and effective sample preparation method for atomic force microscopy visualization of individual DNA molecules in situ. Mol Biol Rep. 38, 965-969 (2010).
- Paulite, M., Fakhraai, Z., Akhremitchev, B. B., Mueller, K., Walker, G. C. Assembly, tuning and use of an apertureless near field infrared microscope for protein imaging. J Vis Exp. , (2009).
- Cretu, A., Castagnino, P., Assoian, R. Studying the effects of matrix stiffness on cellular function using acrylamide-based hydrogels. J Vis Exp. , (2010).
- Brunger, A. T., Weninger, K., Bowen, M., Chu, S. Single-molecule studies of the neuronal SNARE fusion machinery. Annu Rev Biochem. 78, 903-928 (2009).
