Karakteriseren Herbivore resistentiemechanismen: Spittlebugs op Brachiaria Spp. als een voorbeeld

1. Planten Single houtstekken van volwassen planten worden gebruikt als experimentele eenheden. De stekken worden bijgesneden tot 10 cm de uniformiteit van plantmateriaal te verzekeren. Om te voorkomen dat besmetting met plantenpathogenen, zijn de stekken gewassen in een 3% natriumhypochloriet-oplossing gedurende 2 minuten en daarna thoughroughly gespoeld met kraanwater. Elke snijden is geplant in ca. 36 g van steriele grond in een cilindervormige PVC buis (5,3 cm buiten diameter van 6,5 cm hoogte) afgedicht aan de onderkant met een plastic bekertje en afgedekt met een PVC-bus. Het snijden is op zijn plaats gehouden door een foam-ring geplaatst in de centrale opening van de bus. Planten zijn bevrucht en water als nodig is om voldoende bodemvocht te behouden. Planten zullen groeien voor een maand voordat uitgedaagd door insecten, waardoor de ontwikkeling van oppervlakkige wortels, die dienen als voeding sites voor de root-houtvaten geeft spittlebug nimfen. PVC-buizen met gewortelde stekken worden omgekeerd voor 8 d voorafgaand aan de besmetting verder te stimuleren de groei van de oppervlakkige wortels, gedeeltelijk gecorrigeerd voor inherente verschillen in de root architectuur. Deze stap vereist een kunstmatige bron van licht, die we voor 24 ha dag. Om te voorkomen dat confounding ontsnapt uit herbivorie met herbivoor weerstand, individuele plant repliceert met weinig of geen oppervlakkige wortels na deze inversie behandeling zijn geëlimineerd uit het experiment. Deze eliminatie moet worden zeldzaam, nooit leiden tot de eliminatie van het genotype die zij vertegenwoordigen. 2. Insecten Volwassen spittlebugs worden verzameld van het veld, geïdentificeerd naar soort, en voorgesteld aan ovipositie kooien waar ze zijn voorzien van bladeren van gevoelige brachiariagrasses te voeden. Vrouwtjes leggen hun eieren in de bodem die in een ondiepe uitneembare tray geplaatst op de bodem van de kooien. Na een aantal dagen, is de grond gesuspendeerd in water en door een serie van zeven (42, 60 en 150 mesh) om de eieren te verzamelen. Tot schorsing van de gezeefde materiaal in een 30% zoutoplossing zorgt ervoor dat de rijpe eicellen te zweven, met achterlating van onrijpe eieren en eventueel resterende organisch materiaal. Om te voorkomen dat vervuiling door insecten pathogenen, zijn eieren ontsmet een 0,5% natriumhypochloriet-oplossing gedurende 5 minuten en vervolgens gespoeld met gedestilleerd water. Elke test plant (experimentele eenheid) is besmet op het bodemoppervlak met zes rijpe eieren. Alleen rijpe eicellen dicht bij het uitkomen zijn geselecteerd voor plagen. Ze kunnen worden geïdentificeerd door de aanwezigheid van twee rode stippen in hun voorste deel, wat overeenkomt met de ogen van het insect, roze merken in hun achterste deel, wat overeenkomt met de buik van het insect, en een volledig uitgebreid operculum. Succesvol uitkomen is 4 d later bevestigd, op welk moment een unhatched ei wordt vervangen door een pasgeborene spittlebug van onze kolonie. Test planten zijn gerangschikt in een gerandomiseerd compleet blok ontwerp met zes herhalingen per genotype. 3. Evaluaties Het experiment wordt geëvalueerd ca. 30 d na besmetting (exacte tijden zijn afhankelijk van het insect onderzochte species). Schade wordt gescoord op een 1 tot 5 Visuele schaal, waarbij 1 overeenkomt met geen zichtbare schade en 5 komt overeen met een dode plant (Figuur 1). Scoren plant schade geeft een schatting van de tolerantie. Figuur 1. Schade schaal gebruikt om de tolerantie voor spittlebug herbivorie in Brachiaria spp te beoordelen. 1 = geen waarneembare schade, 2 = 0-25% necrotische bladeren, 3 = 25-50% necrotische bladeren, 4 = 50-75% necrotische bladeren, 5 = 75-100% necrotisch blad. Insect overleven wordt beoordeeld door het tellen van de insecten te bereiken ofwel hun laatste instar of volwassen stadium (figuur 2). Scoren voor het insect te overleven geeft een schatting van antibiose. Figuur 2. Spittlebug ontwikkeling van eerste-instar (links) aan volwassen (rechts). Alleen insecten te bereiken op zijn minst hun uiteindelijke instar (pijlen) op de datum van de evaluatie worden geteld als "overlevenden". 4. Representatieve resultaten Resultaten van een representatieve test screening Brachiaria hybriden voor weerstand tegen de spittlebug Aeneolamia reducta zijn weergegeven in figuur 3. Figuur 3. Resultaten van screening Brachiaria hybriden voor de weerstand tegen spittlebug Aeneolamia reducta. Wij beschouwen planten resistent als hun reactie op herbivorie valt in de onderste helft van dit perceel. Antibiose stijgt van rechts naar links en tolerantie neemt toe van boven naar beneden. De pijlen wijzen op onze resistent controles.