Estructura del VIH-1 Asambleas cápside por crio-microscopía electrónica y reconstrucción iterativa helicoidal del espacio real

1. Congelados-hidratados EM preparación de la muestra Dado que el VIH-1 proteína de la cápside (CA) 9 asambleas son estables sólo en sal (NaCl 1M) de amortiguación, lo que contribuye el ruido de fondo fuerte en la crio-ME imágenes, se utiliza una dilución rápida y la espalda del lado del método secante para reducir transitoriamente la sal concentración en la preparación de la red de congelados-hidratados EM. Descarga luminiscente del carbono lado de R2 de malla 200 / 1 mallas de cobre en Quantifoil 25mA durante 25 segundos. Use un nebulizador para que la humedad en la cámara del medio ambiente, una de fabricación casera émbolo gravedad manual, al 80%. En el FEI Vitrobot émbolo dewar, etano líquido frío con nitrógeno líquido. Monte el dewar caída del punto de congelación en el émbolo de la gravedad manual. Aplicar 2,5 l de solución pre-ensamblados CA en el lado de carbono de la red, que se monta en unas pinzas, y la carga de las pinzas en el émbolo con el lado de carbono de la red de espaldas a usted. Añadir 3 l de tampón de dilución baja de sal (NaCl 100 mM) a la parte de atrás de la parrilla e inmediatamente secar la parte de atrás de la parrilla con un trozo de papel de filtro. La superficie de toda la espalda de la parrilla debe estar en estrecho contacto con el papel de filtro durante aproximadamente 6 segundos, antes de retirar el papel de filtro. Inmediatamente caída de la red en etano líquido después de quitar el papel de filtro. Quite las pinzas del émbolo y rápida transferencia de la red en una caja de almacenamiento de red. 2. Crio-microscopía electrónica de CA asambleas tubular La carga de la red congelados-hidratados en un operativo FEI Polara microscopio de electrones G2 en 200kV y equipado con una cámara Gatan 4Kx4K CCD. En dosis bajas-el modo de búsqueda, con un aumento de ~ 200x y con una dosis <0.001e – / A 2, pantalla de toda la parrilla de las zonas con hielo adecuado y guardar las posiciones de estas áreas en un fichero de escenario. Recordar las posiciones de guarda y la pantalla más estas áreas con un aumento de 3.900 x en bajas dosis, el modo de búsqueda. Seleccione las áreas con una capa uniforme y delgada de hielo que contienen bien separados, largos tubos en los agujeros, para la recolección de datos. Guardar la ubicación de estas áreas en un archivo de la segunda etapa. Cambiar a modo de exposición con un aumento de 59.000 x, la inserción de 100 micras de apertura el objetivo, y ajustar la estigmatización objetivo y la intensidad del haz de una dosis de ~ 15 e – / 2 por la exposición. Volver al modo de baja dosis de búsqueda, pasar a una posición guardada e identificar y centro de un tubo de buen uso de la cámara CCD. Cambiar al modo de enfoque, ajuste el enfoque, y establecer un valor de desenfoque, m normalmente entre 0,5 a 2,5. Cambiar al modo de exposición, establezca un tiempo de exposición de 0.3 a 0.5 segundos, para una dosis de 15 e – / A 2, y recoger una imagen. Las imágenes se recogen en una cámara de placa, y las películas deben dejarse en reposo durante 10 segundos antes de que la foto está tomada. Pasar a la siguiente posición guardada y repita el paso 5 para recoger más imágenes. Las películas se desarrollan con toda su fuerza D19 durante 12 minutos y digitalizadas utilizando una Nikon Super Coolscan 9000 ED Escáner en un tamaño de píxel de 6.35 micras. El formato de archivos de imagen TIFF es. 3. Helicoidal de indexación Un objeto helicoidales pueden ser indexados por dos parámetros: el fin de Bessel, n, y el número de capa de línea, l. Cada línea de la capa en la transformada de Fourier, que se caracteriza por (n, l), corresponde a un conjunto de líneas en la red la superficie del objeto helicoidal denota por (h, k) los índices, usando la notación de una red en 2D. Para cualquier (h, k), una línea de capa (n hk, l hk) es una combinación lineal de dos vectores básicos (n = 10, L 10) y (n 01, l 01), que son los valores de n y l las dos principales líneas de capa (1, 0) y L (0, 1). se puede obtener a partir de la altura de la línea de capa medida a lo largo del eje Z en la transformada de Fourier. El valor de n se puede estimar mediante la siguiente ecuación 10 πRr ≈ ≈ 1,1 J n | n | -0,9 …………………( 1) donde J n es la función de Bessel, que determina la intensidad de la línea n º capa, r es el radio del objeto helicoidal, y R es el radio de la amplitud máxima de la línea de la capa. El número de línea de capa, l, se relaciona con n por la regla de selección 11 l = tn + um ………………..( 2) donde T y U son constantes de la hélice. Para cualquier hélice dada, puede haber unidades exactamente u exactamente (o muy cerca) t complete vueltas. Caja con un tubo relativamente recto y largo con un diámetro uniforme con el programa de EMAN 12 helixboxer y guardar la imagen en formato de MRC. Determinar la distancia de repetición helicoidal, c, utilizando un programa basado en la correlación cruzada, tales como "imgccf ', en el paquete de MRC 13. Calcular la transformada de Fourier con una longitud de caja nueva que es una parte integral de la distancia de repetición, c. Elija dos líneas principales que definen la capa de dos vectores básicos de red de superficie (1,0) y (0,1). Medir el radio del tubo, r, y la altura y el radio de las dos líneas principales en la capa transformada de Fourier, l 10, R 10, L 01 ​​R 01, respectivamente (Fig. 1). Calcular n n 10 y 01 de acuerdo a la ecuación (1). Dado que los valores n son sólo estimaciones, unas cuantas combinaciones de n 10 y 01 n se ponen a prueba en pasos posteriores (véase el paso 4.2) para encontrar el correcto uso de la simetría helicoidal IHRSR paquete de programas. Calcular la simetría tornillo descrita por dos números reales: la rotación entre las subunidades (Δφ) y el aumento axial (Δz) de la hélice de una estrella (n = 1). Teniendo en cuenta l 10, l 01, n 10, y los valores de n 01, U y T se puede obtener mediante pruebas de un rango de valores m (por ejemplo, -50 <m <50) de acuerdo con la regla de selección. Por último, Δφ y Δz se calculan utilizando Δφ = 360 t / u, y Δz = c / u. 4. La reconstrucción tridimensional Segmentación de partículas Abrir una micrografía que contiene partículas de helicoidal, con el boxeador programa gráfico, que es un programa en el paquete de EMAN. Corte helicoidal de la partícula en superposición de los segmentos. En el panel de control de Boxer, elegir el modo de hélice y establecer los parámetros para el boxeo: el tamaño de la caja debe ser más grande que el diámetro de la partícula y el valor de "Olap" debe ser aproximadamente el 90% del tamaño de la caja. Después de hacer clic izquierdo en cada extremo de la partícula helicoidal, Boxer se generará automáticamente una serie de cuadros de partículas a lo largo de la longitud de la hélice. Guardar los segmentos de caja, así como sus coordenadas. Inicial de la reconstrucción en 3D utilizando programas IHRSR Invertir el contraste de las imágenes de la crio-ME y aplicar filtros de paso bajo 14 (opcional) antes de su procesamiento con el verdadero método iterativo helicoidal reconstrucción del espacio (IHRSR). Abra la interfaz gráfica del programa de IHRSR escribiendo "generador". Proporcionar la interfaz gráfica con toda la información de la pila de partículas en caja, incluyendo el nombre y la ruta de la pila, el número de imágenes en la pantalla, los valores de los parámetros de simetría, etc Haga clic en el botón "Finalizar" para crear el guión de la reconstrucción, b25.spi. Use un cilindro macizo o hueco, como una referencia inicial y permitir que el procedimiento para el ciclo hasta que no haya cambios en la simetría de tornillo definida, que ocurre generalmente después de algunos ciclos. El derecho de simetría helicoidal debe dar una forma estable de reconstrucción convergente. La reconstrucción generado en el último ciclo se utilizará como referencia inicial para un mayor refinamiento. IHRSR realiza la reconstrucción 3D utilizando programas de SPIDER. Reconstrucción con refinamiento iterativo 15 La reconstrucción 3D generada por IHRSR ahora se utiliza como referencia inicial para el refinamiento adicional. Durante el refinamiento, la simetría helicoidal se fija en Δφ y Δz, que se determinan a partir del procedimiento IHRSR. Determinar el desenfoque y el astigmatismo presentes en la micrografía utilizando programas CTFFIND3 y CTFTILT 16. Multiplicar los segmentos de partículas por el uso de programas CTF SPIDER 17. La operación denominada FT en la sala de SPIDER se utiliza para calcular la transformada de Fourier (FFT) de la imagen 2D. A partir de entonces, la FFT se multiplica por los valores de CTF, determinado en los pasos anteriores, utilizando la operación denominada MU dentro del conjunto de SPIDER. El valor obtenido se transformó inversa hacia atrás para formar una nueva imagen (CTF-corregido) en el espacio real con la operación de SPIDER, FT de nuevo. Realizará comparaciones de proyección mediante la comparación de las proyecciones de los volúmenes de referencia con la CTF-corregido imágenes usando multi-referencia de alineación. La variación en el ángulo de inclinación fuera del avión se limita a + / -10 ° y se tomaron muestras en pasos de 1 °. Introducir restricciones, como los coeficientes de correlación, en el plano ángulos cercanos a 0 º o 180 º, y limitada X turnos, para los parámetros de alineación de cada segmento. Incluir en la reconstrucción sólo aquellos segmentos que satisfacen las restricciones. Después de cada ciclo iterativo refinamiento, una reconstrucción en 3D se genera mediante la proyección de vuelta y se divide por la suma sobre el CTF2. Imponer la simetría helicoidal para generar un volumen simetrizada. El refinamiento iterativo se termina cuando no hay mejora en la resolución de la nueva reconstrucción en 3D se produce. El procesamiento de imágenes SPIDER paquete se utiliza para la mayoría de los pasos de refinamiento. Una serie de operaciones son controladas por los scripts de araña, que son creados por el usuario los archivos de control de proceso por lotes que contienen secuencias de las operaciones y valores de los parámetros. La reconstrucción final se calcula utilizando los programas de SPIDER suite. 5. Los resultados representativos: Un solo de VIH-1 CA A92E tubo (Fig. 1a) estaba en caja y su transformada de Fourier (fig. 1b) se calculó para la indexación helicoidal. Para las líneas de la capa (1, 0) y (0, 1), l 10 = 28, l 01 = 37, R 10 = 55, R 01 = 44. Teniendo en cuenta un radio de tubo de 211.57Å, nos aproxima n 10 =- 12, n 01 = 11 (en este caso, la imparcialidad estaba predeterminado). Con una distancia de repetición de 5195.48Å, la simetría del tornillo del tubo se determinó como Δz = 6.8093Å, Δφ = 328,88 °. Δz y Δφ se perfeccionaron a 7.1321Å y 328,86 ° utilizando IHRSR (Fig. 2a) y la reconstrucción inicial se muestra en la figura. 2b. La reconstrucción final (Fig. 3), después de refinamiento iterativo, la mejora del mapa de densidad de manera significativa a partir del modelo inicial calculada con IHRSR (Fig. 2b). Figura 1. Indexación del VIH-1 CA tubo helicoidal. (A) Un solo por VIH-1 CA de tubo de imagen A92E. Barra de escala, 30 nm. (B) La transformada de Fourier de la sonda se muestra en (A). Los índices helicoidal (n = 10 =- 12, n = 01 11) se indican. Los puntos de punta de flecha a la línea de capa a una resolución de 23 bis. Figura 2. Una reconstrucción inicial con IHRSR. (A) Tornillo de la determinación de la simetría de cada ciclo iterativo. Δφ y Δz, a partir de los valores iniciales, coinciden en los valores estables después de 10 ciclos iterativos refinamiento. (B) El primer mapa 3D de la densidad después de 10 ciclos iterativos. Figura 3. El mapa de densidad de 3D después de que el refinamiento iterativo. (AC) El mapa de densidad de los tubos de CA se muestra como tres rebanadas ortogonal: paralelo al eje del tubo y cerca de la superficie (A), perpendicular al eje del tubo (B), y en paralelo ya través del eje del tubo (C) . Las barras de escala, 10 nm. (D) la representación de la superficie de la mapa de densidad de contornos 3D en 1.8s adjuntando volumen de 100%.