クライオ電子顕微鏡によるHIV - 1キャプシドアセンブリの構造とヘリカル実空間の反復再構成

1。凍結水和したEM試料作製 HIV – 1キャプシドタンパク質（CA）アセンブリ9低温電子顕微鏡の画像で強力なバックグラウンドノイズを寄与する、唯一の高塩（1M NaCl）をバッファで安定しているため、我々は一時的に塩を低減する方法をブロッティング急速希釈し、裏面を使用してください凍結水和したEMグリッドを準備する濃度。 25秒用に25mAの下に200メッシュのR2 / 1 Quantifoil銅グリッドのグロー放電では、炭素側。 80％に、、環境室内の湿度をもたらすために自家製マニュアル重力のプランジャーを噴霧器を使用してください。 FEI Vitrobotプランジャデュワー、液体窒素を使ってクールな液体エタンで。手動の重力のプランジャーにプランジ凍結デュワーをマウントします。 鉗子にマウントされているグリッドの炭素側、上に組み立てられたCAのソリューション2.5μLを適用し、あなたから離れて直面しているグリッドの炭素側とプランジャに鉗子を読み込みます。 グリッドの背面側に低塩の希釈バッファー（100mMのNaCl）を3μlを加え、直ちにろ紙片でグリッドの裏面にしみ。グリッドの全体の裏面には、ろ紙を削除する前に、約6秒間、ろ紙と密接な連絡をしてください。直ちにろ紙を除去した後、液体エタン中にグリッドを突き通す。 プランジ​​ャーから鉗子を外し、すぐにグリッドストレージボックスにグリッドを移す。 2。 CA管状アセンブリの低温電子顕微鏡 200kvでFEI Polara G2電子顕微鏡の動作に凍結水和したグリッドをロードし、ガタン4Kx4K CCDカメラを装備。 低線量の検索モードの下で、<0.001e〜200倍の倍率でと用量との- / Å 2は 、適切な氷のある地域のためのグリッド全体を審査し、stageファイルでこれらの領域の位置を保存する。 低線量の検索モードで3900 xの倍率で保存された位置とさらに画面これらの領域を思い出してください。データ収集のために、穴の上に十分に分離、長い管を含む氷の均一な、薄層で領域を選択します。第二段階のファイルにこれらの領域の場所を保存してください。 露出あたり/ Å 2 – 59000 X、はめ込み100μmの目標の開口部、および〜15 Eの投与のための客観的紅斑出現し、ビーム強度を調整するの倍率で露出モードに切り替えます。 低線量の検索モードに戻るには、保存した位置に移動し、CCDカメラを用いて良好なチューブを識別し、センター。フォーカスモードに切り替えて、フォーカスを調整し、0.5〜2.5μmの間で、通常、デフォーカス値を設定します。露出モードに切り替え、15 Eの投与量については、0.3から0.5秒の露光時間を設定します- / Å 2、および画像を収集する。画像は、プレートのカメラで収集され、露光が行われる前に、フィルムは10秒間静置してください。 次に保存した位置に移動し、より多くの画像を収集するために手順5を繰り返します。 フィルムは12分間フル強度D19で開発され、6.35ミクロンのピクセルサイズでニコンスーパーCOOLSCAN 9000 EDのスキャナを使用してデジタル化されています。画像ファイルの形式はTIFFです。 3。ヘリカルインデックス作成ベッセル次数 n、およびレイヤの行番号、L：ヘリカルオブジェクトは、2つのパラメータでインデックスを作成することができます。として（N、L）を特徴とフーリエ変換の各レイヤの線は、2次元格子から表記を使用して、（H、K）のインデックスで表される螺旋状の物体の表面の格子上にラインのセットに対応しています。任意の（H、K）の場合は、（N HK、L HK）層の線は、NおよびLの値である2つの基本的なベクトル（nは 10、L 10）と（N 01、L 01）、の線形結合である二つの主要層の線（1,0）と（0,1）。lはフーリエ変換でZ軸に沿って測定されたレイヤの行の高さから取得することができます。 nの値は次の式10を用いて推定することができます πRr≈J のn≈1.1 | N | -0.9 …………………( 1） J nは n 番目の層線の強度を決定するベッセル関数、ここで、rはヘリカルオブジェクトの半径であり、そしてRは、層線の最大振幅の半径です。レイヤの行番号、lは 、選択ルール11でnに関連している L = TN + UM ………………..( 2） ここで、t と u は、螺旋の定数である。任意のらせんの場合は、（または非常に密接に）正確にはT Cを正確にuは単位があるかもしれませんompleteになります。 EMANのプログラム12 helixboxerを使用して均一な直径を持つ比較的まっすぐで長いチューブ外箱とMRCの形式で画像を保存する。 MRCのパッケージ13のような"imgccf"として相互相関ベースのプログラムを使用してヘリカルリピート距離、cを 、、、決定する。 繰り返し距離、cの積分である新しいボックスの長さでフーリエ変換を計算する。 二つの基本的な表面の格子ベクトル（1,0）を定義し、（0,1）は、2つの主要な層の行を選択してください。 それぞれ、R 01 L 10、R 10、L 01、管の半径、r、およびフーリエ変換の2つの主要な層の線の高さと半径を測定する（図1）。 式（1）にしたがってnを 10とN 01を計算する。 n個の値しか推定なので、nを 10とN 01のいくつかの組み合わせがプログラムパッケージIHRSRを使用して、正しいらせん対称性を見つけるために（ステップ4.2を参照）後のステップでテストされています。 サブユニット間のローテーション（Δφ）と一つ星のらせん（N = 1）の軸方向の上昇（ΔZ）：2つの実数で記述されたネジの対称性を計算する。 L 10、L 01、N 10、N 01の値を与え、uとtは、選択規則に従ってm個の値の範囲（例えば、-50 <M <50）をテストすることによって得ることができます。最後に、ΔφとΔZはΔφ= 360 T / UとΔZ= C / Uを使用して計算されます。 4。三次元再構築粒子のセグメンテーション EMANのパッケージ内のプログラムのグラフィカルプログラムのボクサーを、使用して、らせん状粒子を含む顕微鏡写真を開きます。 重複するセグメントにヘリカル粒子をカット。ボクサーのコントロールパネルでは、Helixのモードを選択し、ボクシング​​のパラメータを設定する：箱の大きさは粒子の直径よりも大きくする必要があり、"OLAP"の値は、ボックスの大きさの〜90％でなければならない。 ヘリカル粒子のいずれかの端を左クリックした後、ボクサーは自動的にらせんの長さに沿って粒子の一連のボックスを生成します。 箱入りのセグメントだけでなく、それらの座標を保存します。 IHRSRプログラムを使用して初期の三次元再構成低温電子顕微鏡像のコントラストを反転し、反復ヘリカル実空間の再構成法（IHRSR）で処理する前に14（オプション）ローパスフィルタリングを適用する。 "ジェネレータ"と入力してIHRSRプログラムのグラフィカルインタフェースを開きます。スタックの名前とパスを含む箱入り粒子のスタックのすべての情報、とグラフィカルインタフェース、スタック内の画像の数を提供する、対称性のパラメータなどの値は、再建のスクリプトを作成するためのボタン"Finish"をクリックして、 b25.spi。 初期のリファレンスとして実又は中空の円筒を使用し、通常は数サイクル後に発生する定義されているネジの対称性、に変更がないまで、サイクルへの手続きを可能にする。右ヘリカル対称性は、安定的に収束の再建を与える必要があります。最後のサイクルで生成された再建は、さらなる改良のための最初の基準として使用されます。 IHRSRはSPIDERプログラムを使用して三次元再構成を実行します。 反復改良15との再建はIHRSRによって生成された3D再構築は、現在追加の改良のための最初の基準として使用されます。洗練された中に、ヘリカル対称性は、ΔφとIHRSRの手順から決定されるΔZ、に固定されています。 プログラムCTFFIND3とCTFTILT 16を使用して顕微鏡でデフォーカスと非点収差の存在を決定する。 SPIDERプログラム17を使用してCTFによる粒子のセグメントを掛けます。 SPIDERのスイートでFTと呼ばれる操作は、2次元画像のフーリエ変換（FFT）を計算するために使用されます。その後、FFTはSPIDERスイート内のMUと呼ばれる操作を使用して、前の手順で決定した、CTFの値が乗算されます。得られた値は、再び、SPIDERの操作を使用して実空間でのFTを新しいイメージを（CTF補正）を形成する逆変換、逆です。 マルチリファレンスアラインメントを使用して、CTF -補正画像と参照量の予測を比較することによって、投影のマッチングを行います。面外傾斜角の変化は、+ / -10 °に制限し、1 °ステップでサンプリングされます。このような各セグメントのアラインメントパラメータの0 °または180 °、およびX -シフト限定、近くに高い相関係数、面内の角度などの制約を導入する。制約を満たす再建のみのセグメントに含まれています。 それぞれが洗練サイクルを反復した後、3D再構築は、CTFにわたって合計で逆投影を使用して生成され、分割されています2。 対称化ボリュームを生成するらせん対称性を課す。新しい3D復元の解決にはさらなる改善が発生していないときに反復改良は終了します。 画像処理パッケージSPIDERは、洗練されたステップのほとんどに使用されます。一連の操作は、操作とパラメータ値の配列を含むユーザが作成したバッチコントロールファイルであるSPIDERのスクリプトによって制御されます。最終的な再建は、SPIDERスイートでプログラムを使用して計算されます。 5。代表的な結果： 単一のHIV – 1 CA A92Eチューブ（図1a）は、箱入りの出であり、そのフーリエ変換（図1b）はヘリカルインデックス作成のために算出した。レイヤの線（1,0）と（0,1）に対して、L 10 = 28、L 01 = 37、R 10 = 55、R 01 = 44。 211.57Åのチューブの半径を考えると、我々は、N 10 =- 12、nは 01 = 11（ここで、利き手が所定した）近似。 5195.48Åの繰り返しの距離で、管のねじの対称性は、ΔZのように決定された= 6.8093Å、Δφ= 328.88 °。 ΔZ、Δφは7.1321Åと328.86に洗練°でIHRSR（図2a）と初期の再建を使用することは図に示されています。図2b。最終的な復興（図3）、反復改良した後、IHRSR（図2b）で計算された初期のモデルから大幅に密度マップを改善。 図1 HIV – 1 CAヘリカルチューブのインデックス作成。 （A）、単一のHIV – 1 CA A92Eチューブの画像を。スケールバー、30nmの。 （B）フーリエ変換（A）に示すようにチューブの変換。ヘリカル指数（N 10 =- 12、nは 01 = 11）が示されています。 23Aの解像度でレイヤーの線に矢印をポイントします。 図2。IHRSRを使用して初期の再建。各反復サイクルのための（A）スクリューの対称性の決定。 10は改良のサイクルを反復した後、ΔφとΔZは、初期値から開始し、安定した値に収束する。 （B）10、反復サイクル後の最初の3次元密度マップ。 図3。反復改良後の3次元密度マップ。 （AC）CAチューブの密度マップは、3つの直交スライスとして表示されます。チューブ軸に平行して管軸（B）に対して垂直に、表面（）に近い、と平行管軸（C）へと経由。スケールバーは10nm。 （D）3次元密度マップの表面のレンダリングには、100％の体積を囲む1.8sで輪郭。