Isolamento di cellule cardiache funzionali immunitario
Summary
Questo metodo per isolare le cellule immunitarie funzionale dal cuore offre un'alternativa ai metodi convenzionali di digestione collagenasi, che provoca indesiderati attivazione immunitaria delle cellule, con conseguente diminuzione di risposta di queste cellule. Il nostro metodo di isolamento rese funzionali cellule cardiache immunitario evitando problemi legati alla digestione enzimatica.
Abstract
Cardiaco cellule immunitarie stanno guadagnando interesse per i ruoli che svolgono nella rimodellamento patologico in molte malattie cardiache 1-5 Queste cellule del sistema immunitario, che includono i mastociti, le cellule T ei macrofagi;. Immagazzinare e rilasciare una varietà di mediatori biologici attivi tra cui citochine e proteasi, quali triptasi. 6-8 Questi mediatori hanno dimostrato di essere giocatori chiave nel metabolismo della matrice extracellulare, attivando metalloproteinasi della matrice o causare accumulo di collagene modulando il fibroblasti cardiaci 'funzione. 9-11 Tuttavia, le tecniche disponibili per isolare le cellule immunitarie hanno cardiaca stato problematico perché usano collagenasi batterica per digerire il tessuto miocardico. Questa tecnica causa attivazione delle cellule immunitarie e di conseguenza una perdita di funzione. Per esempio, i mastociti cardiaci diventano significativamente meno sensibili ai composti che causano la degranulazione. 12 Perciò, abbiamo sviluppato una tecnica che permette di tche l'isolamento di cellule cardiache funzionali del sistema immunitario che porterebbe ad una migliore comprensione del ruolo di queste cellule nelle malattie cardiache. 13, 14
Questo metodo richiede una certa familiarità con la posizione anatomica del ratto processo xifoideo, ascella e legamento falciforme, pericardio e del cuore. Questi punti di riferimento sono importanti per aumentare il successo della procedura e per garantire una maggiore resa di cellule immunitarie cardiaco. Queste isolato cellule cardiache immunitarie possono quindi essere utilizzati per la caratterizzazione di funzionalità, fenotipo, la maturità e co-coltura con altri esperimenti cellule cardiache per ottenere una migliore comprensione delle loro interazioni.
Protocol
Discussion
Questo metodo di isolare le cellule immunitarie cardiaca permette l'analisi della loro funzione, fenotipo, e la maturità senza l'attivazione indesiderata che si verifica in genere nel corso di una tecnica tradizionale isolamento digestione enzimatica. Il numero medio totale di cellule ottenute con questa tecnica è di circa 400.000 per il cuore di ratto, e colorazione differenziale e l'analisi di citometria a flusso di queste cellule indica popolazione mista di linfociti T (~ 70%), i macrofagi (~ 12%) e mas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da una UNCF-Merck tesi di laurea Science Research Fellowship (JLM), National Heart, Lung, and Blood Institute concede RO1-HL-62228 (JSJ) e RO1-HL-073990 (JSJ).
Materials
| Name of Reagent and Equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
| Hanks’ Balanced Salt | Sigma | H4891 | One bottle makes 1 L of Hanks’ Balance Salt Solution. Reconstitute Hanks’ Balance Salt Solution as a part of the procedure. |
| Antibiotic- Antimyotic | Gibco | 15240-062 | |
| HEPES | Sigma | H3784 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3912 | |
| 250 mL Nalogene Filter Bottle | Thermoscientific | 157-0020 | |
| 12 N HCL | Fisher Scientific | CAS 7647-01-0 | For 6 N, add equal volumes of HCL to deionized water. |
| 10 N NaOH | Fisher Scientific | SC267 | For 5 N, add equal volumes of NaOH to deionized water. |
| Double Distilled Water |
Table of Specific Equipment:
| Name of Reagent and Equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
| 3-O Suture Silk Braided | Ethicon Products | SA64H | |
| Small Animal Ventilator | CWE Incorporated | SAR-830 | Set breathing rate to 40.5 breaths per min. |
| Bevel 18 gauge needle | BD Biosciences | 305199 | Trim needle by 1/2 to 3/4 of its original length for use as a tracheal tube. |
| Teflon Tip (with needle removed) of 24-gauge Baxter quick-cath catheter | Baxter | 2N111 | Reduce the Teflon Tip length by 1/2 to 3/4. |
| 10 cc syringe | Fisher Scientific | 14-823-16B | |
| 15 mL Falcon Tubes | BD Biosciences | 352097 | |
| Sorvall RT6000B Refrigerated Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-377 | Remember to pre-cool and keep at 4°C. |
| Hyclone | Thermoscientific | S300030.02 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | HS-LB-1483 |
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