단백질 치료제 제조 셀 라인의 개발을위한 높은 처리량 자동 플랫폼

1. 숙주 세포에 transfection 종자 2 X 10 15 ML 성장 매체 (세포핵과 nucleosides와 MEMa (Gibco, 카탈로그 번호 12571) 10 % γ – 반구 특징 태아 소 혈청 (cFBS) (HyClone와 보충 T75 코닝 세포 배양 플라스크 6 CHO – DXB11 전지 카탈로그 번호 SH30071.03) 10 ML / 45 % 포도당 용액 (시그마, 카탈로그 번호 G8769)) transfection 전에 하루 L. transfection 당시, 다음과 같이 transfection의 단지를 준비 : 멸균 microcentrifuge 관에서 혈청없이 성장 매체 800 μl 8 μg DNA를 희석. 부드럽게 섞는다. 폴리스티렌 튜브에서 혈청없이 성장 매체 800 μl 40 μl Lipofectamine ™ (Invitrogen 18,324,012)을 희석. 희석 Lipofectamine ™의로 희석 DNA를 추가합니다. 부드럽게 섞어 실온에서 30 분 알을 품다. T75에서 세포의 성장 매체를 제거하고 혈청없이 성장 매체의 6.4 ML로 바꿉니다. 술병에 transfection의 단지의 1.6 ML를 추가합니다. 플레이트 락을하여 부드럽게 섞는다. 6 시간 동안 CO 2 배양기에서 37 ° C 세포를 품어. 37 술병과 부화 ° 하룻밤 CO 2 배양기에서 C로 성장 매체의 8 ML을 추가합니다. 열망으로 매체를 제거하고 플라스크에 신선한 성장 매체를 추가합니다. 하룻밤 CO 2 배양기에서 37 세포 ° C를 품어. (MEMa 매체 세포핵 또는 nucleosides없이 (Gibco, 카탈로그 번호 12561) 10 % γ – 반구 dialyzed 태아 소 혈청 (dFBS) (HyClone, 카탈로그 번호 SH30079.03) 10 ML / L 45과 보충 선택 매체와 성장 매체를 교체 % 포도당 용액 (시그마, 카탈로그 번호 G8769)). 2-3주에 대한 CO 2 배양기에서 37 세포 ° C를 품어. 2. 유동세포계측법 활성 셀 정렬에 의해 복제 4 5 분 동안 800 rpm으로 술병과 원심에서 세포를 이동시키다 ° C. 1시 20분 희석에 2% 소 혈청 알부민과 찬란 분류 안티 인간 IgG 항체와 보충 선택 배지에서 세포를 Resuspend. 15-30분 위해 얼음에 부화 후 차가운 PBS로 두 번 씻는다. 폴리 프로필렌 튜브에 1X PBS로 세포를 Resuspend. BD FACSAria ™에서 무균 정렬 준비. 각 물론 200 μl 선택 매체를 포함 96 – 웰 세포 배양 플레이트를 준비합니다. 무균 세포와 튜브를로드하고 BD FACSAria ™에 대한 분석, 각각 스테인드와 흠없는 세포에 대한 결과를 기록합니다. 96 – 웰 플레이트 (S)에 원하는 형광 염색법 프로필의 단일 세포를 정렬하기 위해 성문과 설정을 설정합니다. Transfected 세포가 처음 기대 산란 대 측면 뿌리를 기반으로 분석됩니다. 라이브 세포 게이트는 세포의 복잡하거나 세분을 측정 셀의 크기, 측면 산란을 측정 앞으로 산란을 기반으로 이루어집니다. 이 게이트 내의 가을 세포는 다음 체육 얼룩에 대해 검사됩니다. PE 부정 게이트는 흠없는 transfected 세포 또는 스테인드 호스트 세포에 대해 설정됩니다. 스테인드 transfected 세포는 FACS에 의한 검사이므로 "높은 PE"게이트는 다음 체육 얼룩에 대한 긍정적인 모든 세포의 상위 5 %를 포괄하는 delineated있다. 두 주 동안 37 ° C 배양기에서 번호판을 품어. 3. CloneSelect ™ 영상기에 의해 식민지 형성의 문서 일 0, 3 일, 정렬 후 FACS 일 7 일 13 CloneSelect 영상기 ™에서 96 – 웰 플레이트 문서의 식민지 형성. 이미지 문서는 단일 세포에서 유래 클론의 선택을 보장합니다. 그 시점에서 각 우물에 하나의 세포가 있기 때문에이 문서에서 중요한 단계는, 당일 공 측정 올바르게 조정 초점 비행기를 받고있다. 그것은 그 하나의 세포의 이미지가 초점에 그들의 초점을 조정하려고 시도하는 것이 최상의 오해를 할 수있는 것이 매우 중요합니다. 초점 비행기는 접시의 브랜드간에 크게 다를 수 있으며 어쩌면 많은에서 같은 브랜드의 많은 수도 있습니다. 따라서 미리 정해진 초점 비행기 사용해야합니다. 이것은 테스트 마이크로 비즈 또는 사용되는 동일한 많은의 접시에 입금 고밀도 세포에 초점을하여 수행할 수 있습니다. 또는 같은 많은에서 자란 플레이트는 이러한 목적으로 사용할 수 있습니다. FACS는 정렬 후, 그들은 접시에 위치에 '고정'될 수 있도록, 세포가 이전 이미지 2 시간의 최소 정착하게하는 것도 중요하다. 4. 심사 및 높은 생산성 클론 선정 수신 96 – 웰 플레이트 분석 문서의 샘플 위치. TECAN 자유 에보 (Evo)에 의해 96 – 웰 플레이트 분석에 20 μl 뜨는 (필요시 희석) ® 액체 처리 시스템의 전송 aliquots. 이것은 유연하고 가능한 로봇IC 플랫폼이 다른 자동 세포 배양 작업에 맞게되었습니다. 특별 프로그램은 최상의 활용 및 세포주 개발을위한 자유 에보 (Evo) 로봇 기능을 향상시키기 위해 작성되었습니다. 이 예제는 하나의 식민지로 우물을 샘플링에 대한 CloneSelect ™ 영상기 데이터를 해석하는 TECAN 설정입니다. 다른 프로그램이 필요한 경우 높은 생산 클론을 확장하기 위해 적절한 해석하는 찍은 샘플 dilutions, 카탈로그 및 샘플 수동으로 표시된 접시를 만들기 위해 같은 추가적인 세포 배양 작업을 수행하는 데 필요한 있었다 이러한 프로그램 등 대부분 쉽게 수 384 잘 접시뿐만 아니라, 원래 96 자 형식으로 적용. 샘플의 항체 생산은 TECAN 자유 에보 (Evo)에서 엘리사를 (피어스, 록퍼드, IL) 검출 샌드위치 인간 IgG ® 액체 처리 시스템에 의해 분석됩니다. 샘플 및 표준 (인간 골수종 IgG1, 카파가) (시그마, 세인트 루이스, MO) 사전에 바이오 코팅 코트 안티 인간 IgG 분석 플레이트 (BD Biosciences, 산호세, CA)에로드되었습니다. 접시 세 PBS에 세척 다음 두 시간 동안 실온에서 incubated했다. ImmunoPure의 염소 안티 – 인간 IgG (FC – 감마) – HRP는 (피어스, 록퍼드, IL) 1:2000 희석에서 판에 추가 및 실내 온도에 한 시간 동안 incubated되었습니다. 접시는 ABTS 기판을 (피어스, 록퍼드, IL) 추가하기 전에 PBS로 세 번 씻어되었으며 검출을위한 405 nm의 흡광도에서를 사용하여 접시 리더에서 읽을 수 있었다. 높은 생산성 클론을 선택하고 서스펜션 문화 생산성을 평가합니다. 먹이 – 배치 문화, 전지가 65578이 (SAFC Biosciences, Lenexa, KS) 5 G / L 간장 hydrolyzate (DMV 국제 카탈로그 번호 SE50MAF – University of Florida의, 많은 보충 단백질 무료로 중간 JRH 즉각적인 기회만에 0.3X106 세포 / ML에 주사를했다 수)와 37 incubated ° C 7.5 % CO 2. 문화 계속해서 2g / L의 포도당 (시그마, 카탈로그 번호 G8769, 많은 번호 098K2329) 문화에 포도당 플러스 젖산 농도가 2g / L 이하에 도달하고, 싫증이 MM 글루타민 (Gibco, 카탈로그 번호 25030와 보충했다 글루타민 수준 200 이하에 도달 많은 번호 568177) MG / L (어떡하지 Bioanalyzer로 측정 metabolites). 연방 – 일괄 문화가 14 일 항체 생산에 대한 해고하는 것은 반대 위상 HPLC로 측정되었다. 원위치 하이브리드화 (물고기) 5 형광에 의해 후보 클론의 유전 특성. 5. 대표 결과 : 높은 처리량 방법과 클론 항체를 생산 개발의 예제는 그림 1과 그림 2에 표시됩니다. Transfected 세포 수영장은 찬란 레이블 안티 인간 IgG 항체 (그림 1A)와 스테인드 분석 BD FACSAria ™ (그림 1B)에 정렬되었습니다. 96 – 웰 플레이트에 콜로니 형성이 CloneSelect 영상기 ™ (그림 1C)에 몇 군데되었습니다. 세포 배양 뜨는은 단일 군락을 포함 우물에서 샘플과 TECAN 자유 에보 (Evo) ® 액체 처리 시스템 (그림 1D)에 엘리사에 의해 assayed했다. 높은 생산성 클론은 형광 레이블 안티 인간 IgG와 얼룩으로 반영 높은 표면 항체 수준을 전시 세포에서 발견되었습니다. 초기 transfected 세포 수영장의 두 인구, 문화 (그림 2) 관찰되었습니다 먹이 – 배치의 생산성에 막대한 차이에서 발생하는 클론을 비교하면. 높은 표면 항체 표현 (PE 높은)와 세포 인구에서 생성된 상위 2 클론 들어, 특정 생산성 50-70에서 원거리 PG / 휴대폰 / 일. 항체 생산성했습니다 반면 ~ 20 PG / 낮은 표면 항체 표현 (PE 낮은)로 세포 인구에서 생성된 상위 2 클론에 대한 셀 / 일. 또한, FACS 정렬 개발한 셀 라인 수동 liming 희석 (그림 3A)를 통해 복제된 것을 그 이상의 항체 생산과 관련하여보다 안정하고 있습니다. 상단 복제의 구체적인 생산성, 수동 liming 희석에 의해 생성된 "복제 1"~ 30에서 80 세포 doublings에 대한 culturing 후 PCD ~ 10 PCD 하락했다. 반면에, "복제 2"정렬 FACS에 의해 생성되는 상단 subclone은 최소 100 세포 doublings 20 PCD 주변 구체적인 생산성을 유지할 수있었습니다. 원위치 하이브리드화 (물고기)에 형광등에 의해, 우리는 코로 1 표현형의 혼합 인구로 나타났다 (85 ​​%)과 표현형 B (15 %).을 증명 대조적으로, FACS는 (복제 인간 2) 클론을 정렬하는 것은 세포의 99.5 %로,보다 균일한 인구로 보여주 표현형 것으로 판명 (그림 3B). 그림 1. CHO 세포에서 단클론 항체의 생산을위한 제조 셀 라인의 개발. 찬란 분류 안티 인간 IgG 항체로 초기 transfected 세포 수영장) 표면 얼룩. B) 96 – 웰 플레이트에 높은 형광 강도 (PE 높은)와 낮은 형광 강도 (PE 낮은)과 세포 인구의 정렬. C) 식민지를 문서화CloneSelect 영상기 ™에 날로부터 형성이 0 일 13 게시물 시딩. 엘리사에 의해 D) 상영 클론. 그림 2. 표면 관련된 항체 수준은 세포의 항체 생산과 연결합니다. 높은 낮은 형광 염색법과 클론은 셀 라인으로 개발 및 공급 – 배치 문화에 평가했다 둘 다. 용적 titer하고 구체적인 생산성은 각 인구의 상위 2 클론 사이에 비교했다. 그림 3. 높은 유전 균질성 및 복제 안정성을 전시 정렬 FACS에서 생성된 클론. 문화 경과 시간 ~ 80 셀 doublings에 대한 배치 문화에 A) 항체 생산 안정성. Δ는 복제는 세포 / 세포에서 잘 2,000 1,000 세포 / 음 500 세포 / 잘 씨앗을 품고 있었다 제한 희석을 통해 생성되었습니다. , 클론는 1 셀 / 마저 FACS를 통해 생성되었습니다. B) CHO 세포 염색체에 Transgene 통합 사이트는 현장 하이브리드화에 형광등에 의해 식별됩니다.