タンパク質治療薬の製造細胞株の開発のためのハイスループット自動化されたプラットフォーム

1。宿主細胞のトランスフェクション 15 mlの増殖培地（10％を添加したヌクレオチドおよびヌクレオシドとMEMA（ギブコ、カタログ番号12571）γ線照射を特徴とするウシ胎児血清（cFBS）（HyClone、でT75コーニングの細胞培養フラスコ内のシード2 × 10 6 CHO – DXB11細胞カタログ番号SH30071.03）および45％グルコース溶液（シグマ、カタログ番号G8769））トランスフェクションの前日の10 mLの/ L。 トランスフェクションの時点で、次のようにトランスフェクション複合体を準備します。 滅菌マイクロ遠心チューブに血清を含まない増殖培地800μlの8μgのDNAを希釈する。穏やかに混合する。 ポリスチレンチューブに血清を含まない増殖培地800μlに40μlのリポフェクタミン™（Invitrogen社18324012）を希釈する。 希釈リポフェクタミン™に希釈したDNAを追加。穏やかに混合し、室温で30分間インキュベートする。 T75の細胞から増殖培地を削除し、血清を含まない増殖培地の6.4 mlを交換してください。フラスコにトランスフェクション複合体1.6 mlを加える。プレートを揺らして穏やかに混合。 6時間CO 2インキュベーターで37セル℃でインキュベートする。 37フラスコとインキュベートする増殖培地8mlを追加で一晩、CO 2インキュベーターでC。 吸引によって培養液を除去し、フラスコに新鮮な増殖培地を追加してください。一晩CO 2インキュベーターで37セル℃でインキュベートする。 （MEMA媒体ヌクレオチドまたはヌクレオシドなし（ギブコ、カタログ番号12561）10％γ線照射透析ウシ胎児血清（dFBS）（HyClone、カタログ番号SH30079.03）と10 mLの/ L 45を添加した選択培地で増殖培地を交換してください％のグルコース溶液（シグマ、カタログ番号G8769））。 2-3週間のためにCO 2インキュベーターで37セル℃でインキュベートする。 2。フローサイトメトリー活性化細胞ソーティングによってクローニング 4℃で5分間800rpmでフラスコや遠沈管から​​細胞を取り除きます℃に 2％ウシ血清アルブミンおよび1:20希釈で蛍光標識した抗ヒトIgG抗体を添加した選択培地で細胞を再懸濁します。 15〜30分間氷上でインキュベートし、冷PBSで2回洗浄する。ポリプロピレンのチューブに1 × PBSで細胞を再懸濁します。 BD FACSAria™上で無菌ソートの準備。各ウェルに200μlの選択培地を含む96ウェル細胞培養プレートを準備します。 無菌的に細胞とチューブをロードし、BD FACSAria™に分析し、それぞれ、ステンドグラスと未染色細胞の結果を記録。 96ウェルプレート（S）に必要な蛍光染色プロフィールの単一細胞をソートするには、ゲートと設定を行います。 トランスフェクションされた細胞は、最初に前方散乱対側方散乱に基づいて分析されます。生細胞用のゲートは、細胞の複雑さや粒度を測定するセルのサイズ、および側方散乱を測定する前方散乱、に基づいて行われます。 このゲート内に入る次に、細胞をPEの染色のために検査されます。 PE負のゲートは、非染色トランスフェクションされた細胞や染色した宿主細胞のために設定されています。染色したトランスフェクトした細胞をFACSで検討されているとして、"ハイPE"ゲートは、PE染色に陽性であるすべてのセルの上位5％を包含するように区切られます。 二週間、37℃のインキュベーターで培養する。 3。 CloneSelect™イメージャによるコロニー形成のドキュメント 0日目、3日目、ソートFACS後7日目および13日目でCloneSelectイメージャ™上で96 – ウェルプレートでの文書のコロニー形成。画像のドキュメントは、単一細胞に由来するクローンの選択を保証します。その時点で各ウェルに1つのセルだけがあるので、このドキュメントの重要なステップは、0日目の測定のために正しく調整されて焦点面を得ています。それは、それらの単一細胞の画像がフォーカスされていることを非常に重要であり、最高の状態でその上にフォーカスを調整しようとすると、誤解を招く可能性があります。焦点面にはプレートのブランド間で大きく異なると可能性もたくさんの同じブランドの多くにできます。したがって、あらかじめ決められた焦点面には使用する必要があります。これは、テストマイクロビーズまたは使用されている同じロットからのプレート上に堆積した高密度の細胞に着目することによって行うことができます。また、同一ロットから十分に成長したプレートは、この目的のために使用されることがあります。 FACSは、ソートした後、彼らはプレート上の位置に"固定"となるように、細胞がイメージングの前に最低2時間のために解決できるようにすることも重要です。 4。生産性の高いクローンのスクリーニングと選択受信側の96ウェルアッセイプレートの文書のサンプル位置。 TECAN自由EVO ®リキッドハンドリングシステムにより、96ウェルアッセイプレートに20μlの上清の転送アリコート（必要に応じて希釈）。この柔軟性と対応ロボットICプラットフォームは、これと他の自動化された細胞培養作業に適応されています。特別なプログラムは、最高の利用と細胞株開発のための自由EVOロボットの機能を強化するために書かれたものです。この例では、単一のコロニーをウェルの中にサンプリングするためのCloneSelect™イメージャのデータを解釈するTECANを設定しています。他のプログラムは、これらのプログラムの多くが容易にできるなど、そのような高産生クローンをスケールアップするために、、必要に応じて手動でプレートをマークカタログやサンプルを、採取されたサンプルの適切な希釈液を作るために解釈するとして、追加の細胞培養のタスクを実行する必要があった384ウェルプレートだけでなく、オリジナルの96ウェルフォーマットに適用。 サンプル中の抗体産生は、ヒトIgGはTECAN自由EVO ®リキッドハンドリングシステム上のELISA（ピアース、ロックフォード、IL）を検出するサンドイッチによって分析されます。 サンプルと標準（ヒト骨髄腫はIgG1、カッパ）（シグマ、セントルイス、MO）は、プレコートバイオコート抗ヒトIgGアッセイプレート（BD Biosciences社、サンノゼ、カリフォルニア州）でロードしました。 プレートは3つのPBSの洗浄に続いて2時間室温でインキュベートした。 ImmunoPureヤギ抗ヒトIgG、（FC -γ）- HRPは（ピアース、ロックフォード、イリノイ州）1:2000の希釈でプレートに添加し、室温で1時間インキュベートした。 このプレートをABTS基質を添加する前にPBSで3回洗浄した（ピアース、ロックフォード、イリノイ州）と検出用の405 nmで吸光度を用いて、プレートリーダーで読んでいた。 生産性の高いクローンを選択して、懸濁培養での生産性を評価する。流加培養のために、細胞を5 g / Lの大豆加水分解物（DMVインターナショナル、カタログ番号SE50MAF – UFを添加した無タンパク質培地JRH直接的なメリット65578で0.3X106細胞/ mL（SAFC Biosciences社、カンザスシティ、ミズーリ）、ロットで接種した番号）と37℃でインキュベートCO 2 7.5％Cを。文化は継続し、2g / Lのグルコース（シグマ、カタログ番号G8769、ロット番号098K2329）培養中のグルコースを加えた乳酸濃度は2g / Lの下に達し、そして供給2mMのグルタミン（Gibco社、カタログ番号25030、を添加したグルタミンのレベルが200以下に到達したロット番号568177）mg / Lであった（YSIバイオアナライザで測定された代謝物）。フェドバッチ培養物を14日と抗体産生を停止させた逆相HPLCにより測定した。 蛍光in situハイブリダイゼーションによる候補クローンの遺伝的特性（FISH）5。 5。代表的な結果： ハイスループットメソッドを使用してクローンを産生する抗体の開発の例を図1および図2に示されています。トランスフェクト細胞プールはBD FACSAria™（図1B）で解析し、ソートされた、蛍光標識した抗ヒトIgG抗体（図1A）で染色した。 96ウェルプレートでのコロニー形成はCloneSelectイメージャ™（図1C）上に結像された。細胞培養上清は、単一のコロニーを含むウェルから採取し、TECAN自由EVO ®リキッドハンドリングシステム（図1D）にELISAによりアッセイした。生産性の高いクローンを蛍光標識した抗ヒトIgGで染色することによって反射されたより高い表面抗体のレベルを示した細胞から発見された。最初のトランスフェクトされた細胞のプールの2つの集団、流加培養で生産性に大きな違いから生成されたクローンを比較するとき（図2）が観察された。高い表面抗体発現（PE高い）を持つ細胞集団から発生した上位2つのクローンの場合は、特定の生産性は50〜70 PG /細胞/日の範囲であった。抗体の生産性のに対し、低表面の抗体の発現（PE低）で細胞集団から発生した上位2つのクローンのための〜20 PG /細胞/日であった。さらに、FACSソーティングにより開発された細胞株は、マニュアル石灰散布の希釈（図3A）を介してクローン化されたものよりも抗体産生に関して、より安定しています。トップクローンの特定の生産性は、手動の石灰散布の希釈によって生成される"クローン1は"、〜30〜80細胞倍加のための培養後にPC​​Dを〜10にPCDを落とした。一方、、"クローン2"ソートFACSによって生成された最上位サブクローンは、少なくとも100細胞の倍加のPCD約20特定の生産性を維持することができた。 in situハイブリダイゼーション（FISH）の蛍光によって、我々は、表現型の混合集団（85％）として示したと表現型B（15％）クローン1を示した。細胞の99.5％が表現型（図3B）であることが証明さとは対照的に、FACSソートされたクローンは、（クローン2）、​​より均質な集団であることを示した。 図1。CHO細胞からモノクローナル抗体の産生のための生産細胞株の開発。 A）蛍光標識した抗ヒトIgG抗体との最初のトランスフェクトされた細胞のプールの表面染色が。 B）を96ウェルプレートに高い蛍光強度（PE高）と低い蛍光強度（PE低）と細胞集団のソート。 C）コロニーの文書化0日目からCloneSelectイメージャ™上では13日後の播種に形成。 D）ELISAによるスクリーニングのクローン。 図2：表面に関連する抗体のレベルは、細胞の抗体産生と相関している。ハイとローの蛍光染色を持つクローンは、細胞株へと発展し、流加培養で評価した両方。体積力価と特異的生産性は、それぞれ人口の上位2つのクローン間で比較した。 図3。高い遺伝的等質性とクローンの安定性を示すソートFACSから生成されたクローン。文化の経過時間の〜80細胞倍加用のバッチ培養でA）抗体の生産の安定性。 Δ、クローンは、細胞がよく2000個/ 1000細胞/ウェル、500細胞/ウェルで播種した限界希釈法、使用して生成されました。 、クローンは、1セル/ウェルでFACSによって生成されました。 B）CHO細胞の染色体における導入遺伝子の組込み部位は、in situハイブリダイゼーション蛍光によって識別されます。