ومنصة عالية الإنتاجية الآلي للتنمية في خطوط التصنيع لخلية التداوي البروتين
Summary
ووصف الإنتاجية العالية ، ومنصة الآلي للتصنيع الخلايا تطوير خط لإنتاج البروتين المداواة. تنفيذ نظام مراقبة الأصول الميدانية دينار بحريني فارز الخلايا الأغنية ، وقد أثبتت CloneSelect تصوير والحرية TECAN EVO نظام مناولة السائل زيادة كبيرة في القدرة على معالجة وضع خط الخلية مع خلية تحسين جودة الخط واستنساخ عالية.
Abstract
الصناعة الصيدلانية البيولوجية التي تنمو بسرعة مطالب التطور السريع لنظم الإنتاج ذات كفاءة عالية وموثوق بها لتلبية الحاجة المتزايدة لإمدادات المخدرات. وقد شمل الجيل خطوط إنتاج الخلية تقليديا العمليات اليدوية التي تتطلب عمالة مكثفة ، وانخفاض الإنتاجية وعرضة لأخطاء بشرية. ونحن هنا التقرير منصة متكاملة عالية الإنتاجية والآلية لتطوير خطوط تصنيع الخلية لإنتاج البروتين المداواة.
مزيج من دينار بحريني FACS الأغنية ™ فارز الخلية ، وتصوير CloneSelect ™ TECAN EVO الحرية مكن ® نظام مناولة السائل خط خلية عالية الإنتاجية وأكثر كفاءة عملية التنمية. في هذه العملية ، يتم transfected first إنتاج الخلايا المضيفة مع ناقلات التعبير يحمل الجين المصالح 1 ، تليها العلاج مع وكيل التحديد. هي ملطخة ثم الخلايا ستابلي – transfected مع مضان المسمى مفتش الأضداد المضادة للبشرية ، وتخضع لاحقا لتحليل التدفق الخلوي 2-4. ويتم اختيار الخلايا المنتجة للغاية على أساس كثافة مضان ومعزولة عن طريق وحيدة الخلية الفرز على ™ FACSAria دينار بحريني. تم الكشف عن تشكيل مستعمرة من مرحلة وحيدة الخلية مجهريا واتخذت سلسلة من الصور الرقمية التي فات الوقت CloneSelect ™ تصوير لتوثيق التاريخ خط الخلية. بعد استنساخ واحدة شكلت ، كما تم عرض هذه الحيوانات المستنسخة لزيادة الإنتاجية التي تجرى على ELISA EVO الحرية TECAN ® السائل نظام المناولة. ويمكن فحص 10000 استنساخ لكل دورة عملية الإعداد مع النظام الحالي — حوالي 2000.
وقد استخدم هذا النهج المتكامل لتوليد ارتفاع إنتاج المبيض الهامستر الصيني خطوط الخلية (شو) لإنتاج الأجسام المضادة وحيدة النسيلة العلاجية (ماب) ، وكذلك البروتينات الانصهار بهم. مع المعونة من أنواع مختلفة من تحقيقات كشف ، يمكن استخدام أسلوب لتطوير علاجات أخرى أو البروتين يمكن تطبيقها على غيرها من نظم إنتاج المضيف. إلى إجراء مقارنة اليدوية التقليدية ، أظهرت هذه المنصة الآلي مزايا زيادة القدرة بشكل ملحوظ ، قابلية التنسيل مضمونا ، التتبع في التاريخ خط الخلية مع الوثائق الإلكترونية وفرصة أقل بكثير في الخطأ المشغل.
Protocol
Discussion
قدمنا خلية التصنيع الآلي الخط الأساسي للتطوير العزلة التي تمكن من استنساخ مثمرة للغاية ، ويعنى في حين ان يضمن قابلية التنسيل استنساخ والاستقرار. إشراك تلوين الأجسام المضادة السطحية تليها فرز FACSAria الخلية ™ هو مفتاح الحصول على الحيوانات المستنسخة واحد مع الضد الإنتاجية العالية. نتائجنا وغيرها من التقارير 2-4 توحي بأن مستوى الأجسام المضادة عرض عابر على سطح الخلية مرتبطة بشكل جيد مع إنتاجية الخلية. وبالتالي ، يمكن استخدام الأجسام المضادة ، مترافق فلوريسئين الاعتراف المنتجات المرتبطة بها والمساعدات غشاء عزل المنتجين عالية. بدلا من ذلك ، وقد استخدمت coexpression الجينات مراسل وهلام microdrop التكنولوجيا لتسهيل اختيار عالية استنساخ بواسطة FACS 6-8. بالإضافة إلى عزل الحيوانات المستنسخة عالية المنتجة عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية ، تطورت تقنيات أخرى لتحقيق نفس الهدف. وتشمل هذه التكنولوجيا تعريشة CellSpot العلوم البيولوجية التي تستخدم أنظمة الكشف عن الأجسام المضادة microspere وتكنولوجيا الليزر لتحديد الفرز استنساخ مثمرة للغاية والقضاء على الخلايا غير المرغوب فيها ، Genetix ClonePix FL StemCell وتقنيات منصة EasyPick ClonaCell تؤدي سرعة عالية فحص خطوط إنتاج الخلية باستخدام نظام كشف الأجسام المضادة الفلورسنت . اخترنا لتنفيذ أسلوب الاستنساخ FACS على أساس مستوى سطح الجسم المضاد يرتبط لأنه يجمع بين سهولة التشغيل والانتقائية على الإنتاجية وقابلية التنسيل.
توظيف الحرية TECAN نظام ® EVO مناولة السائل زيادة كبيرة في إنتاجية الفرز ، والتي توفر الفرصة لاختيار لاستنساخ عالية الغلة من تجمع الخلايا أكبر من ذلك بكثير. أجهزة أخرى لفحص مثل HTRF ، BioForte اللحن الثماني ، HPLC ، الخ ، وجميع الوسائل الممكنة لتحديد وفحص المنتجين عالية من المنتجين منخفضة. من خلال تتبع تشكيل استنساخ مع CloneSelect تصوير ™ ، ولدت لنا الوثائق اللازمة لإثبات قابلية التنسيل رقمية مع خلية خط التاريخ. ويؤكد كذلك قابلية التنسيل التي تميز وراثيا واحد موقع التكامل التحوير على الكروموسوم. وهكذا يمكن خطوة subcloning التي تؤخذ عادة لضمان قابلية التنسيل ، لا يمكن إزالتها. وهذا سيوفر 4-8 أسابيع من الوقت لتطوير خط الخلية. باختصار ، أظهرت نوعية خطوط الخلية التي تم إنشاؤها بواسطة منصة عالية الإنتاجية الآلي إنتاجية عالية ، والاستقرار وتوثيق تاريخ الإنتاج خط الخلية التي يجب أن تلبي الطلب على الانتاج الواسع النطاق والمتطلبات التنظيمية الحالية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name | Company |
| BD FACS Aria™ Cell Sorter | BD Bioscience |
| CloneSelect™ Imager | Genetix |
| TECAN Freedom EVO® liquid handling system | Tecan Group |
References
- Hung, F., Deng, L., Ravnikar, P., Condon, R., Li, B., Do, L., Saha, D., Tsao, Y. S., Merchant, A., Liu, Z., Shi, S. mRNA stability and antibody production in CHO cells: improvement through gene optimization. Biotechnol. J. 5, 393-401 (2010).
- Brezinsky, S. C., Chiang, G. G., Szilvasi, A., Mohan, S., Shapiro, R. I., MacLean, A., Sisk, W., Thill, G. A simple method for enriching populations of transfected CHO cells for cells of higher specific productivity. J. Immunol. Methods. 277, 141-155 (2003).
- Kromenaker, S. J., Srienc, F. Stability of producer hybridoma cell lines after cell sorting: a case study. Biotechnol. Prog. 10, 299-307 (1994).
- Marder, P., Maciak, R. S., Fouts, R. L., Baker, R. S., Starling, J. J. Selective cloning of hybridoma cells for enhanced immunoglobulin production using flow cytometric cell sorting and automated laser nephelometry. Cytometry. 11, 498-505 (1990).
- Henegariu, O., Heerema, N., Wright, L. L., Bray-Ward, P., Ward, D. C., Vance, G. H. Improvements in cytogenetic slide preparation: controlled chromosome spreading chemical aging and gradual denaturing. Cytomery. 43, 101-109 (2001).
- Meng, Y. G. Grenn fluorescent protein (GFP) as a second selectable marker for selection of high producing clones from transfected CHO cells. Gene. 242, 201-207 (2000).
- DeMaria, C. T., Cairns, V., Schwarz, C., Zhang, J., Guerin, M., Zuena, E., Estes, S., Karey, K. P. Accelerated clone selection for recombinant CHO cells using a FACS-based high-throughput screen. Biotechnol. Prog. 23, 465-472 (2007).
- Weaver, J. C. Gel microdrop technology for rapid isolation of rare an high producer cells. Nat. Med. 3, 583-585 (1997).
