在气味诱发反应的钙成像果蝇触角叶

1。安装块组件安装的有机玻璃块（图1A）应作出的蓝图中给出确切的规格（可从 http://neuro.uni-konstanz.de/j ove_mountingblock_blueprint / ）允许易于安装和解剖苍蝇。主题通过从背面的螺丝，但不超出块前，他们的立场将在动物准备调整（见2.7）。 使用精密播种机，在飞的圆形腔上缘的凹痕，挖下的表面，使苍蝇的身体的空间，减少块的厚度，在这一点上。 用手术刀垂直切的铜网和接近底部的缝隙，创造一个“白领”。确保两个结果皮瓣水平，因为这将有助于飞插入。 用牙签安装到上面飞的圆形腔块的强力胶，放置一个小水滴。将胶水和位置上的铜网，使狭缝中心块（图1A）。轻轻按下并删除任何多余的胶水。用的镊子，每侧皮瓣下添加小滴胶水，并在前面块，使狭缝指向垂直向下折叠的网格。确保电网的顶部是块级。允许完全干燥。 组装线架：削减了一半的塑料盖玻片，删除中央的一块做一个“U”形。使用蜂蜡粘上一块导线跨越的“U”的顶端，不使线材过于绷紧。 构建的触角盾：使孔用塑料纸孔，打孔盖玻片。修剪到0.5×0.7厘米的盖玻片的边缘。胶水的镂空的塑料盖玻片胶带，然后将通过孔接触到磁带上的乙醇下降删除的粘合剂。 2。动物的制备相应的基因型的果蝇 – 即轴承所需的“司机”活动，记者转基因组合 – 应该是1-3周;角质层年轻的苍蝇是太软，难以削减。当实验需要，为了配合转基因表达水平直接比较不同基因型，苍蝇应该是年龄相匹配的，以避免与年龄有关的生理上的差异。如果性别并不重要，我们更倾向于使用雌蝇，因为他们有更大的元首和更容易操作。 麻醉苍蝇，在冰上冷却。 安装块引入一个单一的苍蝇。由右翼联合举行的苍蝇和滑动，使背，表面沿缝的铜网，它被暂停其颈部（图1B-C的）。如果有必要，旋转它，直到它低头。 放置在前面的F罚款仙人掌脊柱ly的头，以防止它逃跑（图1B-C的）。放置在前面的长鼻仙人掌脊柱，以防止其移动。仙人掌脊椎修复使用蜂蜡块。确保头顶是块顶部的水平。 解决苍蝇的头块与松香的小水滴（溶于乙醇）。块，放置在一个加湿盒，让约一小时的强化松香。 使用镊子，将触角板和拖放（蜡端出来;见1.5）的持有人之间的天线和头部表皮褶皱线。固定支架与蜂蜡块前。 使用成块建造的螺丝，轻轻向前推线架，创造一些触角板和头部之间的空间。 在苍蝇的头顶部中央位置的孔，将触角盾（见1.6）。蜂蜡修复安装块顶部。 使用刀片分离器，铜TA在磁带上的小孔上盾暴露背后的天线头苍蝇的角质层。孔不应超出眼睛的准备，以防止泄漏。 双组分硅密封孔之间的磁带和角质层。从苍蝇的头顶部删除任何多余的硅。 将一滴果蝇林格氏液的生理盐水（MgCl 2的 2毫米，130毫米氯化钠，氯化钾5毫米，2毫米氯化钙2，蔗糖36毫米，5毫米肝素钠，pH值7.3）的头。确保有没有泄漏：天线应保持完全干燥。使用蓝宝石刀片，切在角质层孔。首先，轻轻地沿着表皮褶皱后面的天线直接得分，然后切沿眼睛整个单眼的背面。最后，折叠打进边缘的一块角质层，从下部切，以避免切断触角神经。 用细镊子小心取出腺体和气管。冲洗多次与果蝇 </em>的林格氏液，头部留下了大降一些。 3。刺激气味传递气味注射器：2毫升的塑料注射器插入到它的清洁钳和吸管（使用过滤嘴）20μL气味稀释后，在适当的溶剂所需，纤维素垫，使用枪头推到每桶垫深。插头和帽的注射器，直到需要。新鲜的气味稀释应准备至少每3个月（或更频繁的高挥发性和/或经常使用的气味），新垫应为每个录制会话之前的气味注射器准备。不要使用超过三刺激气味垫，因为气味浓度会衰减。 定制嗅觉（图2）：主气流（1升/分钟）直接通过聚四氟乙烯管（内部直径0.4毫米）;上游，该管的出口，二次空气流（1升/分钟27厘米）的补充。两种气流所产生的泵膜，流量调节通过两个独立的流量计。空气流，可以通过在煤气洗涤瓶的水加湿，但应小心，以避免过度加湿（即超过〜60％）。二次空气流直接通过气味注射器或一个空的注射器：注射器相连的气流通过注射器针头刺入柱塞（外径1.2毫米）。三路的单位（如哈佛仪器VC6中）通过阀门控制器控制电磁阀用于切换之间的空气清新和刺激气味。 4。 在体内成像我们在这里描述的成像使用一个堂堂正正的荧光显微镜（如直立固定舞台蔡司Axio上考官D1），配备20倍水的目标（例如蔡司W“的计划复消色差透镜”20X / 1,0 M27的迪爱生）（图2）。对于与G-CAMP（激发/发射：488/509纳米）成像，使用滤波器模块具有以下属性：450-490 nm激发过滤器分色镜（T495LP）和500-550 nm发射滤波器（色度等）。将安装块包含在显微镜下的飞。苍蝇的触角面前的嗅觉约0.5厘米的出口位置。 降低的目标，直到它触及林格氏液对果蝇的头部的解决方案。通过观众看明场照明下，位置的准备，所以，在头壳孔为中心，其边界重点。切换到荧光灯和调整的重点，直到你可以看到标记的神经元（从基础的G-CAMP的绿色荧光明显）。 收购了电荷耦合器件图像利益肾小球微调对焦（CCD）相机（如CoolSNAP HQ2数码相机系统）安装在显微镜的使用适当的采集软件（如Metafluor）（图3A）。关闭照明光路中的隔膜限制激发光成像领域。 对于录制的气味诱发活动，采集速率为4赫兹设置和调整曝光时间获得您的CCD相机的动态范围内的荧光值，但不超过1000（任意单位）至少12位的动态分辨率较低。曝光时间不应超过100毫秒，如果可能的话，减​​少的G-CAMP漂白。如果你的相机的空间分辨率允许的话，你可以增加的分级（井数的芯片将进入一个数字像素分级），以减少曝光时间。我们取得的350×225像素（一个2×2的分级），准备在210×135微米的图像。这些设置是最佳捕捉肾小球气味诱导的G-CAMP反应，具有良好的空间和时间分辨率，同时限制记者漂白。 设置测量参数。我们通常记录为10秒（即40帧），气味刺激通常开始收购期开始后的4秒（15帧）和持久的一秒钟（UNTIL 19帧）。一只苍蝇准备通常可以测试高达25-30不同气味的刺激，往往局限于记者，由于漂白的荧光信号不可逆转的下降。刺激间的时间间隔将取决于观察反应的强度和漂白率。可确定适当的刺激间的时间间隔，以避免感官适应长度约反复阳性对照气味（如果已知）中试实验的演示。列入这种气味可以让每〜10在一个给定的一系列刺激核查的持续经营能力和准备的一致响应。 5。数据处理和分析数据处理使用ImageJ的（与Mac插件生物光子学， www.macbiophotonics.ca ）和自定义写在Matlab和R方案如下： 纠正抽样移动文物：将对应一个动物准备（如30测量，每40帧）使用ImageJ的） “刚体”StackReg / TurboReg模式（ bigwww.epfl.ch / thevenaz / stackreg的所有图像。这一步是必需的，以消除在收购框架内和之间的测量标神经元的位置的变化。然而，它是唯一可能消除在XY平面上的变化。如果强的重点发生变化的数据应丢弃。 堆栈段成单个10秒（40帧）测量。 漂白文物的正确曝光荧光灯会导致荧光衰减，在一个单一的测量10。在某些情况下，重要的是要纠正这种衰变分析数据之前。每个测量，计算出一个背景框架。这应该是几帧的平均发病前刺激（如帧6-14）。这backg除以每帧圆框获得相对荧光的变化。由G-CAMP标记的区域内所有像素平均计算每帧的平均相对荧光值。适合双指数的平均荧光曲线，给人更强的重量之前的刺激和权重为零的气味反应的时间（20帧，在我们的例子刺激后发病）的框架。减去从每个像素的相对荧光曲线的拟合曲线。乘以纠正的背景框架，重新获得原始数据帧。这种矫正，可能会导致在反应动力学的修改，如果信号不返回到基线测量结束（例如，如果抑制或非常强烈的兴奋反应诱发）（图4）。校正虽然漂白文物的是在许多情况下非常有用，时间参数的解释应谨慎，如果漂白校正。 计算荧光的相对变化（德LTA，F / F）的每个帧每次测量（F的第I-0）/ F 0 * 100，其中F 0是背景框架（见5.3），和F 我的第i帧的荧光值测量。 计算平均ΔF/ F在肾小球直径为10个像素，以获得活动的痕迹（图5A）（图3B）的兴趣的一个圆形区域内。如果需要，这些痕迹转化为热图使用ImageJ的（图5A）。 ΔF/ F四个帧响应高峰期间的平均刺激前减去平均ΔF/ F四个帧，计算峰值振幅的响应。同样的程序使用说明空间响应模式（见图3B）和量化在跨苍蝇利益的特定区域响应的幅度（见图5B）。也可以量化的峰值响应，结合曲线下的面积，在时间的刺激，或averagin克帧左右的最大响应。 6。代表结果我们使用了上述协议，以记录和分析丙酸诱发反应苍蝇嗅觉合作的的受体IR8A，这是活跃在几个不同的嗅觉神经元的人口29,30（表达启动子的控制下的G-CaMP1.6 28图3-5）。 1％丙酸的刺激引起的G-CAMP荧光的增加 – 这表明细胞内钙的增加 – 在嗅觉神经元支配两个肾小球，DC4〜DP1l（图3B）。我们代表从多个苍蝇在图5中的数据说明了不同的方式：行活动的痕迹，热图和酒吧情节的峰值响应。丙酸诱发反应有明显的峰值幅度在DC4〜和DP1l和时空动态。此外，虽然反应一般健壮，动物个体之间的变异性也可以被观察（看到他都肾小球图5A atmaps）。量化的峰值响应（图5B），允许简单的统计比较不同肾小球和动物之间的不同气味。然而，气味诱发的钙反应可以有非均匀的时空动态，量化与一个单一的值，其规模将无视这种复杂性。 图1。安装块示意图（a）在（二）引进后飞，和（c）在近距离顶视图（改编）从31。 图2。实验设置的示意图。 （一）2.8步后（左图）和原始赌注的荧光图像的飞行准备的顶视图图3。NNAL叶标记与G-CaMP1.6（基因型：IR8A子：GAL4的;无人机G-CaMP1.6）。 DC4〜和DP1l肾小球内可区分它们的形态，大小和位置，并在标有红色和蓝色，分别。 （二）彩色编码图像丙酸（1％V / V）的响应。图像对应的ΔF/ F响应峰值计算步骤5.6解释（参见图5A）。左侧colorscale表示％ΔF/ F值。黑色圆圈表示，用量化的反应（见图5）的利息区域的位置和大小。 图4。纠正漂白的荧光记者的信号。漂白矫正效果，在步骤5.3中所述的例子。没有重大变化响应的形状，在左侧面板上的样本数据，可以得到纠正。在右侧面板中的样本数据是严重影响漂白校正，可能因为信号下降和气味刺激终止后保持低于基线。 图5（a）顶：DC4〜肾小球（左）和DP1l（右）丙酸（1％V / V）的钙离子反应的时空动态。黑色痕迹表明在该地区的利益，跨越8个动物（见图3B）的平均ΔF/ F的中位数。灰色表面之间的分布在第一和第三四分表示的范围。演讲中位数和四分位值，观察到的反应比均值和标准差的变异和分布提供了更多的信息。绿色和洋红框显示帧平均计算如图3B所示，在图5B量化的峰值响应。底部：热图显示为单独的行中的所有动物个体的响应数据，ΔF/ F值再版esented由的colorscale（右一）。水平黑边显示的时间和持续时间的刺激。 （二）跨越8个DC4〜DP1l肾小球的动物到丙酸的中位数峰值响应。错误横道之间的第一和第三四分分布范围。