חקירות תנועתיות החיצונית Cell שיער עם שילוב של גירוי חיצוני לסירוגין שדה חשמלי במהירות גבוהה ניתוח תמונה
Summary
שיטה אמינה לחקור תא השיער החיצוניים (OHC) תגובות ניעתי, כולל electromotility, תנועתיות איטית כיפוף, הוא תיאר. תנועתיות OHC הוא שהושרו על ידי גירוי חיצוני עם שדה חשמלי לסירוגין, ואת השיטה מנצלת את הקלטת במהירות גבוהה התמונה, מבוססי LED תאורה, הדור האחרון התמונה תוכנת ניתוח.
Abstract
OHCs הם גלילי תאים הסנסורית ממוקם האיבר של קורטי, איבר השמיעה בתוך האוזן הפנימית יונקים. השם "תאים שיער" נובעת צרור apical האופיינית שלהם stereocilia, אלמנט קריטי עבור איתור התמרה של אנרגיה צליל 1. OHCs מסוגלים לשנות צורה, להאריך, לקצר, לכופף בתגובה גירוי חשמלי, מכני כימי, תגובת המנוע נחשב חיוני שבלול הגברה של אותות אקוסטיים 2.
הגירוי גורם OHC ניעתי שתי תגובות שונות: i) electromotility, תנועתיות מהירה aka, שינויים באורך בטווח המיקרו נגזר חשמלית המונעת שינויים קונפורמציה בחלבונים מנוע בצפיפות בקרום פלזמה OHC, ו ב) תנועתיות איטית, משנה את צורתו ב אלפית שנייה כדי שניות טווח מעורבים מחדש cytoskeletal 2, 3. OHC כיפוף קשורה electromotility, והתוצאה גם מהפצת אסימטרית של חלבונים מנוע בקרום פלזמה לרוחב, או גירוי חשמלי אסימטרית של חלבונים אלה המנוע (למשל, עם שדה חשמלי הניצב לציר הארוך של התאים) 4. גירויים מכניים וכימיים לעורר תגובות ניעתי איטי בעיקרו, למרות שינויים בתנאי יוניים של תאים ו / או בסביבה שלהם יכול גם לעורר את הפלזמה קרום מוטבע מנוע חלבונים 5, 6. מאז התגובות OHC ניעתי הם מרכיב חיוני של המגבר שבלול, ניתוח איכותי וכמותי של התגובות הללו ניעתי בתדרים אקוסטי (בערך מ – הרץ 20-20 קילוהרץ בבני אדם) היא עניין חשוב מאוד בתחום של שמיעה המחקר 7.
הפיתוח של טכנולוגיית הדמיה חדש המשלב מהירות גבוהה במצלמות וידאו, מערכות מבוססות LED תאורה, תוכנה מתוחכמת ניתוח התמונה עכשיו מספק את היכולת לבצע איכותי ואמין מחקרים כמותיים התגובה ניעתי של OHCs מבודד לשדה חשמלי חיצוני לסירוגין (EAEF) 8. זוהי טכניקה פשוטה ולא פולשנית אשר עוקף את רוב המגבלות של הגישות הקודמות 9-11. יתר על כן, מערכת תאורה מבוססי LED מספק בהירות קיצוני עם אפקטים תרמיים מבוטל על דגימות, ובשל השימוש במיקרוסקופ וידאו, רזולוציה אופטית הוא לפחות פי 10 יותר מאשר עם טכניקות קונבנציונאלי מיקרוסקופ אור 12. למשל, עם הגדרת הניסוי המתואר כאן, שינוי אורך התא של כ -20 ננומטר יכול להיות שגרתי זוהה באופן מהימן בתדירויות של 10 קילוהרץ, ועל החלטה זו ניתן לשפר עוד יותר בתדרים נמוכים.
אנו בטוחים כי זו גישה ניסויית יסייע להרחיב את הבנתנו את המנגנונים המולקולריים שבבסיס הסלולר תנועתיות OHC.
Protocol
Discussion
שיטת הניסוי המוצג כאן מאפשר לאמוד תגובות OHC ניעתי בטווח kHz ללא הגבלה כלשהי לתנועה של התא. פרוטוקולים שונים של גירוי, סמנים נוספים (microspheres), כמו גם שינויים בכיוון של התא ביחס השדה החשמלי, מאפשרים לחקור היבטים חדשים של תנועתיות OHC עם רמת הפירוט נגישים קודם לכן. שיטות אחרות…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה נתמכת על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקים R01DC10146/R01DC010397, NIDCD P30 DC006276 Core המחקר, HEI. התוכן שלה הוא אך ורק באחריות הכותבים ואינם מייצגים בהכרח את הדעות הרשמיות של NIH או HEI. המחברים מצהירים שום סכסוך קיימים או פוטנציאליים של עניין.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Leibovitz’s L-15 | Gibco | 21083 | |
| Collagenase (Type 4) | Sigma-Aldrich | C5138 | 1mg/mL in L-15 |
References
- Frolenkov, G. I. Genetic insights into the morphogenesis of inner ear hair cells. Nat Rev Genet. 5, 489-498 (2004).
- Ashmore, J. Cochlear outer hair cell motility. Physiol Rev. 88, 173-210 (2008).
- Dallos, P., Fakler, B. Prestin, a new type of motor protein. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 3, 104-111 (2002).
- Frolenkov, G. I. Cochlear outer hair cell bending in an external electrical field. Biophys. J. 73, 1665-1672 (1997).
- Matsumoto, N., Kalinec, F. Extraction of Prestin-Dependent and Prestin-Independent Components from Complex Motile Responses in Guinea Pig Outer Hair Cells. Biophys J. 89, 4343-4351 (2005).
- Matsumoto, N., Kalinec, F. Prestin-dependent and prestin-independent motility of guinea pig outer hair cells. Hear Res. 208, 1-12 (2005).
- Ashmore, J. The remarkable cochlear amplifier. Hear Res. 266, 1-17 (2010).
- Kitani, R., Kakehata, S., Kalinec, F. Motile responses of cochlear outer hair cells stimulated with an alternating electrical field. Hearing Research. , (2011).
- Dallos, P., Evans, B. N. High-frequency outer hair cell motility: corrections and addendum. Science. 268, 1420-1421 (1995).
- Frank, G., Hemmert, W., Gummer, A. W. Limiting dynamics of high-frequency electromechanical transduction in outer hair cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 96, 4420-4425 (1999).
- Santos-Sacchi, J. On the frequency limit and phase of outer hair cell motility: effects of the membrane filter. J. Neurosci. 12, 1906-1916 (1992).
- Inoué, S. . Video Microscopy. , (1986).
