El aislamiento de islotes humanos de pacientes parcialmente Pancreatectomized

1. La colección de tejidos del páncreas en la sala de operaciones El cirujano realiza una resección parcial del páncreas. Después de colocar la muestra de páncreas en una caja de hielo, de presentar inmediatamente al patólogo. 2. Selección del tejido para el aislamiento de islotes El patólogo selecciona tejido que parece suave y saludable, manteniendo el tejido dañado con fines de diagnóstico. Tejido fibrótico y las muestras que ofrecen menos de 2 g de tejido útil están excluidos de aislamiento de islotes. Sumergir el tejido pancreático en euros solución Collins y entregar en hielo al laboratorio. 3. Aislamiento de islotes humanos Pese el tejido pancreático, a continuación, colóquelo en un plato de 10 cm. Ponga 150 ml RPMI medios de comunicación en un frasco de 500 ml. En un matraz de 250 ml, prepare la solución de enzimas digestivas mediante la combinación de 130 ml RPMI medios de comunicación con 100 mg / ml y 20 ml DNasa de RI Liberase 5mg/ml. Draw 10 ml de esta solución en una jeringa para inyectar el tejido pancreático. Se inyecta la solución de enzimas digestivas en el tejido pancreático, con el objetivo de que se distienden homogénea. Si se trata de prevenir la fibrosis, la digestión es probable que no. A continuación, picar los tejidos en ~ 4 mm 3 piezas en el hielo. 4. Páncreas humano circuito de la digestión Montar el circuito de la digestión, como se muestra en la Figura 1. La dirección del flujo en la cámara de Ricordi se encuentra en la parte inferior y salida en la parte superior de la cámara. Añadir la solución de enzimas digestivas restante en el matraz de 500 ml hasta un volumen total de 300 ml e insertar un termómetro. Transferir el tejido pancreático en la cámara, inserte la malla (diámetro de poro: 600 m) y tres canicas de nitruro de silicio (diámetro: 15 mm), cerca de la cámara y encienda la bomba con el caudal fijado en 140 ml / min. Cuando la temperatura del circuito llega a 37 ° C, iniciar el cronometraje y periódicamente toman muestras para determinar el momento de detener la digestión. Tinción con ditizona (2 mg / ml) permite la visualización microscópica de los islotes dentro del tejido digerido 4. Una vez que los islotes están separados del tejido acinar alrededores, rápidamente detener la digestión mediante la colocación de la bobina de calentamiento sobre el hielo y añadir 200 ml de medio de lavado en frío (900 ml RPMI 1640 con 5,5 mM de glucosa y 10% de SFB) al circuito. Recoger la solución de los islotes en 250 ml tubos cónicos como sale del tubo de muestra. Continúe hasta que el circuito está vacío. Figura 1. El circuito de la digestión humana páncreas El páncreas circuito de la digestión humana incluye una cámara de Ricordi que contiene la malla (diámetro de poro: 600 m) y tres bolas de nitruro de silicio (diámetro: 15 mm). Salida de la cámara es impulsada en el matraz de recogida de tejidos por la bomba peristáltica (140 ml / min). Las flechas indican la dirección del flujo. Una temperatura óptima para la digestión enzimática se mantiene mediante la inmersión de la bobina de calentamiento en un baño de agua a 37 ° C. 5. Lavado después de la digestión Centrífuga de 250 ml tubos cónicos que contengan la solución de los islotes a 1.000 rpm, 4 º C durante 5 min. Descartar el sobrenadante, resuspender el precipitado de los islotes en los medios de comunicación de lavado (900 ml RPMI 1640 con 5,5 mM de glucosa y 10% de SFB) y distribuirlo en fracciones iguales a tubos de 50 ml cónicos. (Opcional:. Distribuir en tubos cónicos adicionales para mejorar el lavado) Se centrifuga a 1000 rpm, 4 º C durante 5 min. Desechar el sobrenadante y extraiga con cuidado pellets por agitación manual. 6. La purificación en un gradiente de Ficoll Resuspender el precipitado con Ficoll los medios de comunicación a una densidad de 1,125 g / ml, pH 7,4, y poco a poco superposición de alícuotas de 10 ml de Ficoll los medios de comunicación con una densidad de 1,080, 1,060 y 1,037 g / ml. Centrifugar los gradientes de Ficoll a 2400 rpm, 4 º C durante 20 min. 7. Colección islote y Cultura Después de la centrifugación, los diferentes componentes del tejido se pueden distinguir por su repartición en el degradado. Descartar la capa superior que consta de grasa y tejido conectivo. Con cuidado, la cosecha de la primera capa de áridos islote en la 1.037-1.060 g / ml interfase. Esta capa contiene los islotes aislados más puro. Recoger las fracciones por separado para el aislamiento eficiente. Recoger la fracción de segundo, menos puro de los agregados de los islotes en el 1.060-1.080 g / ml interfase. Diluir el gradiente de Ficoll mediante la adición de medio de lavado (900 ml RPMI 1640 con 5,5 mM de glucosa y 10% de SFB) a cada tubo cónico hasta un volumen total de 50 ml. Centrifugar a 1000 rpm, 4 º C durante 5 min. Eliminar el sobrenadante por aspiración. Tenga cuidado de que la pastilla esté suelto debido al gradiente de Ficoll. Lave el wi pelletsª lavar los medios de comunicación (900 ml RPMI 1640 con 5,5 mM de glucosa y 10% de SFB) y se centrifuga a 1000 rpm, 4 º C durante 5 min. Repita el uso de los medios de comunicación islote cultura Resuspender los islotes en los medios de cultivo y colocarlos en la incubadora con 5% de CO 2 a 37 ° C durante 24-48 horas antes de su posterior procesamiento.