部分的に膵臓を摘出された患者からのヒト膵島の単離
Summary
研究のための2型糖尿病膵島の供給が不十分です。ここでは、膵部分切除を受けた患者からの膵島を単離するための我々のプロトコルを共有しています。このアプローチは、2型糖尿病と基礎および臨床研究のための十分な数の臨床的にマッチした非糖尿病患者からの膵島を得るためのユニークな会場を表します。
Abstract
2型糖尿病とランゲルハンス故障1の島の病因の調査は、臓器提供者2からの2型糖尿病膵島の限られた可用性によって妨げられている。ここでは、2型糖尿病と異なる膵疾患（良性または悪性膵腫瘍、慢性膵炎、および総胆管や十二指腸腫瘍）による膵部分切除を受けた非糖尿病患者から得られたヒト膵組織からの膵島を単離するための我々のプロトコルを共有する。関係するすべての患者はまた、地元の倫理委員会によって承認されていたこの研究に同意を与えた。手術標本は、直ちに診断目的のために損傷した組織を維持し、膵島分離のために柔らかで健康的に出現する膵組織を選択した病理医に届けられました。我々は1,000以上の島を分離することがわかった、我々は、膵組織の少なくとも2gを開始しなければならなかった。我々のプロトコルにも不可欠の酵素含有培地を注入するときに目に見えて組織を膨張させると、続いて表面積を増やすことによって消化を助けるためにそれをミンチにしました。
ヒト膵臓組織の大量（> 15グラム）が使用できる偶発症例を含めるために、我々のプロトコルの適用性を拡張するために、我々は組織を消化するためにRicordiのチャンバー（50ml）を使用。消化中に、我々は、手動で組織の線維化のそのレベルに応じて試料によって変化する強度でRicordiのチャンバ3を横に振った。不連続フィコール勾配は、その後、腺房組織から膵島を分離するために使用されていました。我々は、組織ペレットが均一に1.125グラム/ mlの密度でフィコール培地に再懸れるのに十分小さくする必要があることに注意。単離後、我々は彼らの機能回復を促進するために、少なくとも48時間、37時、5％CO 2でストレスフリーの条件（無揺れや回転）° C下で膵島を培養。我々のプロトコルとその将来の改良の広範なアプリケーションが大幅に2型糖尿病の研究を進め、糖尿病と臨床的にマッチした非糖尿病患者からヒト膵島の大量のタイムリーな収穫を有効にすることができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
私たちのプロトコルを使用して、ヒト膵島は、膵部分切除から収集した膵臓組織から単離することができる。このプロトコルの成功は、いくつかの重要なポイントの間に取られた心配に依存しています。 β-細胞生存率を維持するために、それは、試験片を実験室に氷上で急速に輸送されることが不可欠です。さらに、組織の消化の期間は、組織の線維化とメディアの酵素活性の等級に応じて経験的に最適化する必要があります。これはRicordiのチャンバーに手動で適用される機械的な力の程度についても同様です。したがって、良好な膵島収量を得るために、プロトコルは最適な、専用の科学者や技術アシスタントによって実行されます。チームはすでに膵島分離に経験されていない限り、初期不良が主流です。
私たちの膵島分離プロトコルと標準的なヒト膵島分離法の主な違いがあります：1）我々は手術中に虚血の数時間を受けた膵臓組織を使用していますが、それはすぐにサイト上で処理されますが。これは、割り当ておよび膵島分離施設への納入時に数時間のために虚血性のまま膵臓/膵島移植のための脳死患者からの外植膵臓とは対照的です。標準プロトコルは、膵管にそれを注入することであるのに対し、2）我々は、膵臓の組織に直接コラゲナーゼを注入する。 3）我々は、代わりにCOBEセルのプロセッサを使用して連続フィコール勾配から膵島を集めるの不連続フィコール勾配を使って島を区切ります。
手術標本があまりにも線維性または膵島の十分な数を単離するための不足しているケースでは、組織はまだレーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）10によって取得することができます。これは、膵島分離に失敗した場合でも、遺伝子発現データは、ほぼすべての試料から回収することができますまたは収率が非常に低いです。残念ながら、LCMは、機能的な研究のために生きている細胞を生成しませんし、その量は、プロテオーム解析のための一般的には不十分である。このように、膵島を取得するために私たちのコラゲナーゼ消化プロトコルと並行してLCMを使用すると手術標本を処理するために最も効果的な方法かもしれない。
部分的pancreatectomiesからの膵島分離のために組織を収集する場合、それは患者の病歴や代謝の状態を慎重に調べることが重要です。部分的に膵臓を摘出された患者は、型3C糖尿病、手術6につながる膵臓疾患に続発すなわち糖尿病の影響を受ける可能性があります。 2010年に当科でこの手術を受けた43参加した患者のうち、32は非糖尿病だった、5は2型糖尿病の影響を受け、6種類3C糖尿病を持っていた。これらのデータは、グルコース代謝の障害と膵癌や慢性膵炎6から患っている患者のかなりの割合で糖尿病を指している以前の研究に同意する。それは膵臓の手術7につながる症状の発症前に少なくとも一年と診断された場合、我々は、一次起源であることが糖尿病を考慮。膵島自己抗原に対する抗体のレベルはまた、糖尿病8の潜在的な自己免疫の起源を評価するために測定する必要があります。膵切除術を受けた患者は、未診断の糖尿病を患うまたはグルコース不耐症になる可能性があるため、すべての非糖尿病患者は膵切除9以前に経口ブドウ糖負荷試験を付与する必要があります。
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、プロジェクトのさまざまな段階で助け、アドバイスと重要な入力を提供する私たちの多くの同僚に感謝したいと思います。このビデオの記事の生産は、教育と研究のためのドイツ省（BMBF）から糖尿病研究のためのドイツ語センター（DZDへの資金でサポートされていましたhttp://www.dzd-ev.de IMIDIA（、） のhttp://www 。imidia.org ）と技術ドレスデンの大学の大学病院カールグスタフケーラス。これらの結果につながる研究は、助成金協定N ° 115005の下で革新的医学イニシアティブに関する欧州共同体の第七次フレームワーク計画（FP7/2007-2013）から資金を受けています。
Materials
| Name | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Equipment | ||
| 1 ml serological pipette (CELLSTAR) | greiner bio-one | 604181 |
| 10 ml serological pipette (CELLSTAR) | greiner bio-one | 607180 |
| 25 ml serological pipette (CELLSTAR) | greiner bio-one | 760180 |
| 10 ml Syringe | BD (Becton, Dickinson and Company) | 300912 |
| 50 ml Syringe | BD (Becton, Dickinson and Company) | 300865 |
| 5 ml Syringe | BD (Becton, Dickinson and Company) | 309050 |
| 18 G 1,1/2 Needle Microlance 3 | BD (Becton, Dickinson and Company) | 304622 |
| 27 Gx1/2 Needle | Braun | 4658300 |
| 27 Gx3/4 Needle Microlance 3 | BD (Becton, Dickinson and Company) | 302200 |
| 3 cm cell culture dish 2×2 mm grid | Nunc | 174926 |
| 20 cm Tissue culture dish | BD (Becton, Dickinson and Company) | 353003 |
| 6 cm Easy grip petri dish | BD (Becton, Dickinson and Company) | 351016 |
| 150 ml storage bottle | Corning Incorporated | 431175 |
| 250 ml Erlenmeyer flasks | Schott Duran | 21 217 36 |
| 500 ml Erlenmeyer flasks | Schott Duran | 21 217 44 |
| 250 ml Screw Cap Conical Bottom Centrifuge Tube | Corning Incorporated | 430776 |
| 50 ml Falcon conical tube | BD (Becton, Dickinson and Company) | 352070 |
| 260 ml Easyflask Non-treated | Nunc | 156800 |
| Millex GV Filter Unit Duropore (0,22 μm) | Millipore | SLGV033RB |
| Bottle Top Vacuum Filter (PES 70 mm Diameter Membran, 0,22 μm pore size, 45 mm neck size, 500 mL volume) | Corning Incorporated | 431118 |
| Densitometer (Densito 30PX) LWE37463 | Mettler Toledo | 51324450 |
| Fast PES Filter Unit 0,2 μm | Nalgene | 569-0020 |
| Heating Coil | BioRep Technologies Inc | HC-02 |
| Multifuge 4 KS-R | Heraeus | 75015680 |
| Pump Typ PD5206 | Heidolph | 523-52060-00-2 |
| Ricordi chamber (metal mesh with 600 μm pore diameter) | BioRep Technologies Inc. | Model 50-U-01, Serial 0503-001 |
| Preparation Stand | BioRep Technologies Inc. | 50-PS-01 |
| O-Rings | BioRep Technologies Inc. | OR-50-U-01 |
| Silicon Nitride Marbles (15 mm set of 9) | BioRep Technologies Inc. | SN-01 |
| Silicon Tubing | Tygon | R 3603 8,0X4,0 mm |
| Surgical forceps | Braun | BD168R |
| Surgical scissors (Aesculap) | Braun | BC273R |
| Water bath OLS 200 | Grant | OLS 200 |
| Reagents | ||
| Collagenase -> Liberase RI (100 mg) | Roche | 11815032001 |
| D(+)-Glucose | Merck | 1.08337.1000 |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Merck | 1.16743.1000 |
| Diphenylthiocarbazone (DTZ) | Sigma Aldrich | D5130 |
| DNase I (100 mg) | Roche | 10104159001 |
| Dulbeccos 1xPBS | PAA Laboratories | H15-002 |
| Electrolytsolution E154 | Serumwerk | 00509 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | PAA Laboratories | A15-101 |
| Ficoll 400 | Sigma Aldrich | F9378 |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 |
| 2-(4-(2-Hydroxyethyl)- 1-piperazinyl)-ethansulfons‰ure (HEPES) | Roth | 9105.3 |
| NaOH, 5 M | clinical pharmacy, hospital | – |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | PAA Laboratories | P11-010 |
| Pipettaid (EXPRESS) | BD (Becton, Dickinson and Company) | 357591 |
| Potassiumchlorid | Fluka | 60132 |
| Potassiumdihydrogenphospate anhydrous | JT Baker | 0241 |
| Potassiummonohydrogenphosphate | JT Baker | 3246-01 |
| RPMI Medium 1640 [-]D-Glucose [+]L-Glutamine | Gibco | 11879-020 |
| RPMI Medium 1640 [+]L-Glutamine | PAA Laboratories | E15-840 |
| Sodiumhydrogencarbonat | Merck | 1.06329.0500 |
Media and Solutions
Dithizone Solution
- Dissolve 100 mg DTZ in 10 ml DMSO and dilute in 40 ml PBS
- Sterile filter the solution (0.22 μm)
Enzyme Solution
- Dissolve 100 mg Liberase RI in 20 ml RPMI 1640 media (without supplements)
- Dissolve 100 mg DNase in 1 ml RPMI 1640 media (without supplements)
- Sterile filter the solution (0.22 μm) and keep the enzyme on ice
Wash media (1000ml/5.5mM Glucose)
- Dissolve 100 ml FBS (heat inactivated)
- Add 450 ml RPMI 1640 (no glucose)
- Add 450 ml RPMI 1640 (11 mM glucose)
- Sterile filter the solution (0.22 μm)
Islet culture media (500ml/5,5mM Glucose)
- Dissolve 10 ml 1M HEPES (pH 7.4)
- Add 50 ml FBS
- Add 5 ml penicillin/streptomycin (100x)
- Add 2.75 ml 1 M Glucose Solution
- Add 432.25 ml RPMI 1640 (no glucose)
- Sterile filter the solution (0.22 μm)
Euro Collins Solution
- 4,083 g potassium hydrogenphosphate
- 70,0 g glucose
- 2,237 g potassium chloride
- 14,80 g potassium monohydrogenphosphate
- 1,680 g sodium hydrogencarbonate
- 40 ml electrolyte solution (E 154)
- pH 7.4
- Add distilled water up to 2000 ml
- Sterile filter the solution (0.22 μm)
Ficoll Stock Solution
- Add 1000 ml of Euro Collins Solution to 500 g Ficoll
- Add 8.94 g HEPES
- Stir overnight until Ficoll is solved
- pH 7.4
- Measure the density
Ficoll Gradients
- Calculate the amount of FBS, Euro Collins Solution and Ficoll Stock Solution according to the density
- Combine the 3 solutions and measure the density with a densitometer
- Add Euro Collins Solution or Ficoll Stock Solution until the density is adjusted
- Sterile filter the solution (0.22 μm) and store at 4°C
References
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