Isolamento di isole umane da pazienti parzialmente Pancreatectomized

1. Collezione di tessuti del pancreas in sala operatoria Il chirurgo esegue una resezione parziale del pancreas. Dopo aver posizionato il campione del pancreas in una scatola su ghiaccio, lo consegnerà immediatamente al patologo. 2. Selezione dei tessuti per l'isolamento delle isole Il patologo seleziona tessuto che appare morbida e sana, mantenendo il tessuto danneggiato per scopi diagnostici. Campioni di tessuto fibrotico e offrendo meno di 2 g di tessuto utilizzabile sono esclusi dalla isolamento delle isole. Immergere il tessuto pancreatico in soluzione di Euro Collins e fornire sul ghiaccio al laboratorio. 3. Isolamento di isole umane Pesare il tessuto pancreatico, poi metterlo in un piatto da 10 cm. Mettere 150 ml RPMI dei media in un pallone da 500 ml. In un pallone da 250 ml, preparare la soluzione enzima digestivo, combinando 130 ml RPMI media con 100 mg / ml di DNasi e 20 ml di RI Liberase 5mg/ml. Disegna 10 ml di questa soluzione in una siringa per iniettare il tessuto pancreatico. Iniettare la soluzione di enzima digestivo nel tessuto pancreatico, al fine di distendere la omogeneo. Se questo è impedito da fibrosi, la digestione probabilmente fallire. Poi, tritare il tessuto in ~ 4 mm 3 pezzi su ghiaccio. 4. Pancreas umano circuito digestione Montare il circuito digestione, come mostrato nella Figura 1. La direzione del flusso nella camera di Ricordi è in basso e fuori nella parte alta della camera. Aggiungere la restante soluzione enzima digestivo al pallone da 500 ml fino ad un volume totale di 300 ml e inserire un termometro. Trasferire il tessuto pancreatico nella camera, inserire le maglie (pori di diametro: 600 micron) e tre Marmi nitruro di silicio (diametro: 15 mm), chiudere la camera e avviare la pompa con il flusso fissato a 140 ml / min. Quando la temperatura del circuito raggiunge i 37 ° C, inizio i tempi e periodicamente prelevare campioni per determinare quando interrompere la digestione. Colorazione con ditizone (2 mg / ml) permette la visualizzazione di isolette microscopiche all'interno del tessuto digerito 4. Una volta le isole sono separate dal tessuto acinare circostante, in modo rapido fermare la digestione ponendo la batteria di riscaldamento sul ghiaccio e aggiungendo 200 ml di supporti lavaggio a freddo (900 ml RPMI 1640 con 5,5 mM di glucosio e il 10% FBS) al circuito. Raccogliere la soluzione isolotto in 250 ml provette coniche come si esce dalla provetta. Continuare fino a quando il circuito è vuoto. Figura 1. L'uomo circuito digestione pancreas Il pancreas umano circuito digestione comprende una camera di Ricordi che contiene mesh (pori di diametro: 600 micron) e tre palline di nitruro di silicio (diametro: 15 mm). Uscita dalla camera è spinto al pallone raccolta tessuto dalla pompa peristaltica (140 ml / min). Le frecce indicano la direzione del flusso. Una temperatura ottimale per la digestione enzimatica viene mantenuta immergendo la bobina di riscaldamento in un bagno d'acqua a 37 ° C. 5. Lavaggio post-digestione Centrifuga da 250 ml provette coniche contenente la soluzione isolotto a 1000 rpm, 4 ° C per 5 min. Eliminare il surnatante, risospendere il pellet isolotto a lavare i media (900 ml RPMI 1640 con 5,5 mM di glucosio e il 10% FBS) e distribuirlo in frazioni pari a 50 ml provette coniche. (Opzionale:. Distribuire in tubi conici aggiuntive per migliorare il lavaggio) Centrifugare a 1000 rpm, 4 ° C per 5 min. Gettare il surnatante e delicatamente allentare pellet agitando manuale. 6. Purificazione su un gradiente di Ficoll Risospendere il pellet con Ficoll i media ad una densità di 1,125 g / ml, pH 7.4 e lentamente sovrapposizione di 10 ml di Ficoll mezzi con densità di 1,080, 1,060 e 1,037 g / ml. Centrifugare i gradienti di Ficoll a 2400 rpm, 4 ° C per 20 min. 7. Isolotto Raccolta e Cultura Dopo la centrifugazione, componenti del tessuto differenti si distinguono per la loro scomposizione del gradiente. Eliminare lo strato superiore costituito da grassi e tessuto connettivo. Accuratamente raccolto il primo strato di inerti isolotto alla g / ml 1,037-1,060 interfase. Questo strato contiene le isole più puro isolato. Raccogliere separatamente le frazioni per l'isolamento efficiente. Raccogliere la seconda frazione meno puro di aggregati isolotto alla g / ml 1,060-1,080 interfase. Diluire il gradiente di Ficoll con l'aggiunta di lavare i media (900 ml RPMI 1640 con 5,5 mM di glucosio e il 10% FBS) a ciascuna provetta conica fino ad un volume totale di 50 ml. Centrifugare a 1000 rpm, 4 ° C per 5 min. Eliminare il surnatante tramite aspirazione. Usare la stessa attenzione il pellet potrebbe essere sciolto a causa del gradiente di Ficoll. Lavare il wi pellet° lavare i media (900 ml RPMI 1640 con 5,5 mM di glucosio e il 10% FBS) e centrifugare a 1000 rpm, 4 ° C per 5 min. Ripetere utilizzando terreni di coltura isolotto Risospendere le isolette in terreni di coltura e metterli in incubatore al 5% di CO 2 a 37 ° C per 24-48 ore prima di ulteriori elaborazioni.