L'isolement des îlots humains à partir des patients partiellement pancréatectomisés

1. Collecte de tissus pancréatiques dans la salle d'opération Le chirurgien effectue une résection partielle du pancréas. Après avoir placé le spécimen du pancréas dans une boîte sur la glace, le livrer immédiatement à l'anatomopathologiste. 2. Sélection de tissus pour l'isolement des îlots Le pathologiste sélectionne tissu qui semble douce et saine, tout en conservant les tissus endommagés à des fins diagnostiques. Tissu fibreux et les spécimens offrant moins de 2 g de tissu utilisable sont exclus de l'isolement des îlots. Immerger le tissu pancréatique en Euro Collins Solution et livrer sur la glace au laboratoire. 3. L'isolement des îlots humains Peser le tissu pancréatique, puis le placer dans un plat de 10 cm. Mettez 150 ml de RPMI médias dans un flacon de 500 ml. Dans un flacon de 250 ml, préparer la solution d'enzymes digestives en combinant 130 ml de RPMI médias avec 100 mg / ml et 20 ml de DNase de RI Libérase 5mg/ml. Draw 10 ml de cette solution dans une seringue pour injecter le tissu pancréatique. Injecter la solution d'enzymes digestives dans les tissus du pancréas, visant à la dilater de façon homogène. Si cela est empêché par la fibrose, la digestion sera probablement échouer. Ensuite, émincer les tissus dans ~ 4 mm 3 pièces sur la glace. 4. Homme circuit de la digestion du pancréas Assemblez le circuit de digestion comme le montre la figure 1. La direction du flux dans la chambre de Ricordi est dans le bas et dehors au dessus de la chambre. Ajouter la solution d'enzymes digestifs restant dans le ballon de 500 ml pour un volume total de 300 ml et insérer un thermomètre. Transfert du tissu pancréatique dans la chambre, insérer le treillis (diamètre des pores: 600 um) et trois billes nitrure de silicium (diamètre: 15 mm), à proximité de la chambre et démarrer la pompe avec le flux fixé à 140 ml / min. Lorsque la température du circuit atteint 37 ° C, commencer à chronométrer et périodiquement prélever des échantillons afin de déterminer quand arrêter la digestion. Coloration à la dithizone (2 mg / ml) permet la visualisation microscopique des îlots au sein du tissu digéré 4. Une fois les îlots sont séparés du tissu acineux environnantes, arrêter rapidement la digestion en plaçant la bobine de chauffage sur la glace et ajouter 200 ml de milieu lavage à froid (900 ml de RPMI 1640 avec 5,5 mM de glucose et 10% de FBS) pour le circuit. Recueillir la solution îlot dans 250 ml tubes coniques comme elle sort du tube échantillon. Continuez jusqu'à ce que le circuit est vide. Figure 1. Le circuit de pancréas humain la digestion Le circuit pancréas humain de digestion comprend une chambre de Ricordi contenant mailles (diamètre des pores: 600 um) et trois billes de nitrure de silicium (diamètre: 15 mm). Les sorties de la chambre est entraîné dans la fiole de collecte des tissus par la pompe péristaltique (140 ml / min). Les flèches indiquent la direction du flux. Une température optimale pour la digestion enzymatique est maintenue en immergeant le serpentin de chauffage dans un bain d'eau à 37 ° C. 5. Lavage après la digestion Centrifuger les tubes coniques de 250 ml contenant la solution îlot à 1000 rpm, 4 ° C pendant 5 min. Jeter le surnageant, resuspendre le culot îlot au milieu de lavage (900 ml de RPMI 1640 avec 5,5 mM de glucose et 10% de FBS) et le distribuer dans des fractions égales à tubes de 50 ml conique. (Facultatif:. Répartir dans des tubes coniques supplémentaires pour améliorer le lavage) Centrifuger à 1000 rpm, 4 ° C pendant 5 min. Rejeter le surnageant et les boulettes de détacher doucement en secouant manuel. 6. La purification sur gradient de Ficoll Reprendre le culot avec Ficoll médias à une densité de 1,125 g / ml, pH 7,4 et lentement superposition aliquotes de 10 ml de Ficoll des médias avec des densités de 1,080, 1,060 et 1,037 g / ml. Centrifuger les gradients de Ficoll à 2400 rpm, 4 ° C pendant 20 min. 7. Collection Islet et de la Culture Après centrifugation, les composants des tissus différents peuvent être distingués par leur cloisonnement dans le dégradé. Jeter la couche supérieure constituée de tissus adipeux et conjonctifs. Soigneusement la récolte de la première couche de granulats à l'îlot de 1,037 à 1,060 g / ml d'interphase. Cette couche contient les îlots les plus purs isolés. Recueillir les fractions séparément pour l'isolement efficace. Recueillir le second, la fraction moins pur des agrégats à l'îlot de 1,060 à 1,080 g / ml d'interphase. Diluer le gradient de Ficoll en ajoutant des médias de lavage (900 ml de RPMI 1640 avec 5,5 mM de glucose et 10% de FBS) à chaque tube conique jusqu'à un volume total de 50 ml. Centrifuger à 1000 rpm, 4 ° C pendant 5 min. Jeter le surnageant par aspiration. Faites attention que le culot soit lâche due au gradient de Ficoll. Lavez le wi granulése laver les médias (900ml RPMI 1640 avec 5,5 mM de glucose et 10% de FBS) et centrifuger à 1000 rpm, 4 ° C pendant 5 min. Répétez l'aide de milieux de culture des îlots Resuspendre les îlots de milieux de culture et de les placer dans l'incubateur avec 5% de CO 2 à 37 ° C pendant 24-48 heures avant traitement ultérieur.