عزلة الإنسان الفشوت من المرضى مستأصل البنكرياس جزئيا
Summary
المعروض من الجزر من النوع 2 السكري للبحوث غير كافية. هنا نحن لدينا حصة بروتوكول لعزل الجزر من المرضى الذين يخضعون لاستئصال البنكرياس جزئيا. هذا النهج يمثل فرصة فريدة للحصول على الجزر من السكري من النوع 2 وغير المتطابقة سريريا السكري الموضوعات بأعداد كافية للدراسات الأساسية والسريرية.
Abstract
وقد أعاق التحقيقات في إمراض السكري من النوع 2 والجزر من خلل انجرهانز 1 من محدودية الجزر السكري نوع 2 من 2 المتبرعين بالأعضاء. هنا نحن لدينا حصة بروتوكول لعزل الجزر من نسيج البنكرياس الإنسان الحصول عليها من مرضى السكري من النوع 2 السكري وغير المرضى الذين خضعوا لاستئصال البنكرياس جزئيا بسبب أمراض مختلفة البنكرياس (أورام حميدة أو خبيثة البنكرياس ، التهاب البنكرياس المزمن ، والقناة الصفراوية المشتركة أو الأورام الاثني عشر) . أعطى جميع المرضى المشاركين موافقتهم على هذه الدراسة ، التي لديها أيضا تمت الموافقة من قبل لجنة الأخلاق المحلية. على الفور تم تسليم العينات الجراحية إلى الطبيب الشرعي الذي اختار ناعمة وصحية أنسجة البنكرياس تظهر للعزلة الجزيرة ، الإبقاء على الأنسجة التالفة لأغراض التشخيص. كنا قد وجدنا أن لعزل أكثر من 1000 جزيرة ، لتبدأ على الأقل 2 غرام من نسيج البنكرياس. من الضروري أيضا أن بروتوكول جهدنا ليتمدد بشكل ملحوظ عند حقن الأنسجة وسائل الإعلام التي تحتوي على انزيم واللحم المفروم لاحقا للمساعدة على الهضم من خلال زيادة مساحة السطح.
لتوسيع نطاق تطبيق بروتوكول لتشمل حالة عرضية فيه كمية كبيرة (> 15G) من نسيج البنكرياس البشرية المتاحة ، واستخدمنا غرفة Ricordi (50 مل) لهضم الأنسجة. خلال عملية الهضم ، ونحن هزت يدويا غرفة Ricordi 3 في شدة أن تتفاوت من العينة وفقا لمستواها من تليف الأنسجة. واستخدمت بعد ذلك التدرج Ficoll discontinous لفصل الأنسجة من الجزر عنيبية. لاحظنا أن بيليه الأنسجة يجب أن تكون صغيرة بما يكفي لتكون معلق في وسط متجانس Ficoll مع كثافة 1.125 غرام / مليلتر. بعد عزلة ، ونحن المثقفين الجزر في ظل ظروف خالية من الإجهاد (لم تهتز أو التناوب) مع 5 ٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة على الأقل من أجل تسهيل تعافيهم وظيفية. ويمكن تطبيق البروتوكول على نطاق واسع لدينا وتحسينها في المستقبل تمكين الحصاد في الوقت المناسب لكميات كبيرة من الجزر البشرية من مرض السكري والمتطابقة سريريا الموضوعات غير مصاب بالسكري ، والمضي قدما إلى حد كبير البحوث داء السكري من النوع 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
باستخدام بروتوكول لدينا ، ويمكن الإنسان من الجزر المعزولة أنسجة البنكرياس التي جمعت من استئصال البنكرياس الجزئي. نجاح هذا البروتوكول يعتمد على الرعاية التي اتخذت خلال نقطة حرجة قليلة. للحفاظ على سلامة خلايا بيتا ، فمن الضروري أن يتم نقل العينات بسرعة على الجليد إلى المختبر. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن يكون الأمثل مدة الهضم الأنسجة تجريبيا وفقا لدرجة تليف الأنسجة والنشاط الأنزيمي من وسائل الإعلام. هذا ينطبق أيضا على درجة من القوة الميكانيكية المطبقة يدويا إلى غرفة Ricordi. وبالتالي الحصول على محصول جيد جزيرة ، يتم تنفيذ بروتوكول أفضل من قبل عالم مخصصة أو مساعد تقني. الفشل الأولي هو القاعدة ما لم يتم بالفعل فريق من ذوي الخبرة في عزلة الجزيرة.
هناك اختلافات رئيسية بين جزيرة لدينا بروتوكول العزلة والعزلة مستوى جزيرة البشرية الأسلوب : 1) على الرغم من أننا استخدام أنسجة البنكرياس تعرض لعدة ساعات من نقص التروية أثناء إجراء الجراحة ، ويتم معالجتها على الفور في الموقع. هذا هو على النقيض من بنكرياسات explanted من الدماغ ميت المانحين لالبنكرياس / جزيرة الزرع الدماغية التي تبقى لعدة ساعات خلال تخصيص وتسليمها للمنشأة جزيرة العزلة. 2) نحن كولاجيناز حقن مباشرة في أنسجة البنكرياس ، في حين أن البروتوكول هو معيار لضخه في القناة البنكرياسية. 3) ونحن منفصلة الجزر باستخدام التدرج Ficoll متقطع بدلا من جمع الجزر من الانحدار المستمر Ficoll باستخدام معالج الخلية كوبي.
في الحالات التي تكون فيها عينة جراحية نادرة جدا أو تليفي لعزل عدد كاف من الجزر ، لا يزال الأنسجة التي يمكن استرجاع microdissection التقاط الليزر (LCM) 10. هذا يسمح استرداد البيانات من عينة التعبير الجيني تقريبا ، حتى إذا فشل أو العزلة جزيرة العائد منخفض جدا. للأسف ، LCM لا تنتج الخلايا الحية للدراسات الفنية وقيمتها غير كافية عادة لتحليل البروتين. وبالتالي ، قد تستخدم LCM بالتوازي مع شركائنا كولاجيناز بروتوكول الهضم لاسترداد الجزر تكون الطريقة الأكثر فعالية لمعالجة العينات الجراحية.
عند جمع الأنسجة لعزلة الجزيرة من pancreatectomies جزئية ، من المهم أن تدرس بعناية التاريخ المريض السريرية والأيض الدولة. وقد يتأثر المريض مستأصل البنكرياس جزئيا حسب نوع 3C السكري ، أي مرض السكري الثانوي إلى اضطراب البنكرياس مما يؤدي إلى عملية جراحية 6. وكان من بين المرضى الذين خضعوا ل43 المشاركة في هذه الجراحة ادارتنا في عام 2010 ، 32 منهم كانوا غير مصابين بالبول السكري ، تتأثر 5 من مرض السكري من النوع 2 و 6 من النوع 3C السكري. هذه البيانات تتفق مع دراسات سابقة تشير إلى اختلال عملية التمثيل الغذائي ومرض السكري الجلوكوز في جزء كبير من المرضى الذين يعانون من سرطان البنكرياس أو التهاب البنكرياس المزمن 6. اعتبرنا أن مرض السكري المنشأ الأساسي إذا تم تشخيص ما لا يقل عن عام واحد قبل ظهور الأعراض التي تؤدي إلى جراحة البنكرياس 7. وينبغي أيضا على مستويات الأجسام المضادة ضد autoantigens جزيرة تقاس لتقييم الأصل الذاتية المحتملة للمرض السكري 8. لأن المريض يمكن أن يمر استئصال البنكرياس يعانون من مرض السكري دون تشخيص أو أن يكون الجلوكوز التعصب ، ينبغي إعطاء جميع المرضى غير المصابين بالبول السكري an تحمل الغلوكوز الفموي اختبار مسبق لاستئصال البنكرياس 9.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نريد ان نشكر العديد من زملائنا الذين قدموا المساعدة والمشورة والمدخلات الحاسمة في مختلف مراحل المشروع. وأيد الإنتاج من هذه المادة الفيديو مع أموال من وزارة البيئة الألمانية للتعليم والبحوث (BMBF) إلى المركز الألماني لأبحاث السكري (DZD ، http://www.dzd-ev.de ) ، IMIDIA ( http://www . imidia.org ) ومستشفى جامعة كارل غوستاف كاروس في جامعة دريسدن التقنية. تلقى البحوث المؤدية إلى هذه النتائج على تمويل من برنامج الاتحاد الأوروبي الإطاري السابع (FP7/2007-2013) للمبادرة مبتكرة في إطار منحة الطب الاتفاق رقم 115005.
Materials
| Name | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Equipment | ||
| 1 ml serological pipette (CELLSTAR) | greiner bio-one | 604181 |
| 10 ml serological pipette (CELLSTAR) | greiner bio-one | 607180 |
| 25 ml serological pipette (CELLSTAR) | greiner bio-one | 760180 |
| 10 ml Syringe | BD (Becton, Dickinson and Company) | 300912 |
| 50 ml Syringe | BD (Becton, Dickinson and Company) | 300865 |
| 5 ml Syringe | BD (Becton, Dickinson and Company) | 309050 |
| 18 G 1,1/2 Needle Microlance 3 | BD (Becton, Dickinson and Company) | 304622 |
| 27 Gx1/2 Needle | Braun | 4658300 |
| 27 Gx3/4 Needle Microlance 3 | BD (Becton, Dickinson and Company) | 302200 |
| 3 cm cell culture dish 2×2 mm grid | Nunc | 174926 |
| 20 cm Tissue culture dish | BD (Becton, Dickinson and Company) | 353003 |
| 6 cm Easy grip petri dish | BD (Becton, Dickinson and Company) | 351016 |
| 150 ml storage bottle | Corning Incorporated | 431175 |
| 250 ml Erlenmeyer flasks | Schott Duran | 21 217 36 |
| 500 ml Erlenmeyer flasks | Schott Duran | 21 217 44 |
| 250 ml Screw Cap Conical Bottom Centrifuge Tube | Corning Incorporated | 430776 |
| 50 ml Falcon conical tube | BD (Becton, Dickinson and Company) | 352070 |
| 260 ml Easyflask Non-treated | Nunc | 156800 |
| Millex GV Filter Unit Duropore (0,22 μm) | Millipore | SLGV033RB |
| Bottle Top Vacuum Filter (PES 70 mm Diameter Membran, 0,22 μm pore size, 45 mm neck size, 500 mL volume) | Corning Incorporated | 431118 |
| Densitometer (Densito 30PX) LWE37463 | Mettler Toledo | 51324450 |
| Fast PES Filter Unit 0,2 μm | Nalgene | 569-0020 |
| Heating Coil | BioRep Technologies Inc | HC-02 |
| Multifuge 4 KS-R | Heraeus | 75015680 |
| Pump Typ PD5206 | Heidolph | 523-52060-00-2 |
| Ricordi chamber (metal mesh with 600 μm pore diameter) | BioRep Technologies Inc. | Model 50-U-01, Serial 0503-001 |
| Preparation Stand | BioRep Technologies Inc. | 50-PS-01 |
| O-Rings | BioRep Technologies Inc. | OR-50-U-01 |
| Silicon Nitride Marbles (15 mm set of 9) | BioRep Technologies Inc. | SN-01 |
| Silicon Tubing | Tygon | R 3603 8,0X4,0 mm |
| Surgical forceps | Braun | BD168R |
| Surgical scissors (Aesculap) | Braun | BC273R |
| Water bath OLS 200 | Grant | OLS 200 |
| Reagents | ||
| Collagenase -> Liberase RI (100 mg) | Roche | 11815032001 |
| D(+)-Glucose | Merck | 1.08337.1000 |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Merck | 1.16743.1000 |
| Diphenylthiocarbazone (DTZ) | Sigma Aldrich | D5130 |
| DNase I (100 mg) | Roche | 10104159001 |
| Dulbeccos 1xPBS | PAA Laboratories | H15-002 |
| Electrolytsolution E154 | Serumwerk | 00509 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | PAA Laboratories | A15-101 |
| Ficoll 400 | Sigma Aldrich | F9378 |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 |
| 2-(4-(2-Hydroxyethyl)- 1-piperazinyl)-ethansulfons‰ure (HEPES) | Roth | 9105.3 |
| NaOH, 5 M | clinical pharmacy, hospital | – |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | PAA Laboratories | P11-010 |
| Pipettaid (EXPRESS) | BD (Becton, Dickinson and Company) | 357591 |
| Potassiumchlorid | Fluka | 60132 |
| Potassiumdihydrogenphospate anhydrous | JT Baker | 0241 |
| Potassiummonohydrogenphosphate | JT Baker | 3246-01 |
| RPMI Medium 1640 [-]D-Glucose [+]L-Glutamine | Gibco | 11879-020 |
| RPMI Medium 1640 [+]L-Glutamine | PAA Laboratories | E15-840 |
| Sodiumhydrogencarbonat | Merck | 1.06329.0500 |
Media and Solutions
Dithizone Solution
- Dissolve 100 mg DTZ in 10 ml DMSO and dilute in 40 ml PBS
- Sterile filter the solution (0.22 μm)
Enzyme Solution
- Dissolve 100 mg Liberase RI in 20 ml RPMI 1640 media (without supplements)
- Dissolve 100 mg DNase in 1 ml RPMI 1640 media (without supplements)
- Sterile filter the solution (0.22 μm) and keep the enzyme on ice
Wash media (1000ml/5.5mM Glucose)
- Dissolve 100 ml FBS (heat inactivated)
- Add 450 ml RPMI 1640 (no glucose)
- Add 450 ml RPMI 1640 (11 mM glucose)
- Sterile filter the solution (0.22 μm)
Islet culture media (500ml/5,5mM Glucose)
- Dissolve 10 ml 1M HEPES (pH 7.4)
- Add 50 ml FBS
- Add 5 ml penicillin/streptomycin (100x)
- Add 2.75 ml 1 M Glucose Solution
- Add 432.25 ml RPMI 1640 (no glucose)
- Sterile filter the solution (0.22 μm)
Euro Collins Solution
- 4,083 g potassium hydrogenphosphate
- 70,0 g glucose
- 2,237 g potassium chloride
- 14,80 g potassium monohydrogenphosphate
- 1,680 g sodium hydrogencarbonate
- 40 ml electrolyte solution (E 154)
- pH 7.4
- Add distilled water up to 2000 ml
- Sterile filter the solution (0.22 μm)
Ficoll Stock Solution
- Add 1000 ml of Euro Collins Solution to 500 g Ficoll
- Add 8.94 g HEPES
- Stir overnight until Ficoll is solved
- pH 7.4
- Measure the density
Ficoll Gradients
- Calculate the amount of FBS, Euro Collins Solution and Ficoll Stock Solution according to the density
- Combine the 3 solutions and measure the density with a densitometer
- Add Euro Collins Solution or Ficoll Stock Solution until the density is adjusted
- Sterile filter the solution (0.22 μm) and store at 4°C
References
- Kahn, S. E., Zraika, S., Utzschneider, K. M., Hull, R. L. The beta cell lesion in type 2 diabetes: there has to be a primary functional abnormality. Diabetologia. 52, 1003-1012 (2009).
- Deng, S., Vatamaniuk, M., Huang, X., Doliba, N., Lian, M. M., Frank, A., Velidedeoglu, E., Desai, N. M., Koeberlein, B., Wolf, B., Barker, C. F., Naji, A., Matschinsky, F. M., Markmann, J. F. Structural and functional abnormalities in the islets isolated from type 2 diabetic subjects. Diabetes. 53, 624-632 (2004).
- Ricordi, C., Lacy, P. E., Finke, E. H., Olack, B. J., Scharp, D. W. Automated method for isolation of human pancreatic islets. Diabetes. 37, 413-420 (1988).
- Latif, Z. A., Noel, J., Alejandro, R. A simple method of staining fresh and cultured islets. Transplantation. 45, 827-830 (1988).
- Ehehalt, F., Knoch, K., Erdmann, K., Krautz, C., Jäger, M., Steffen, A., Wegbrod, C., Meisterfeld, R., Kersting, S., Bergert, H., Kuhlisch, E., Bornstein, S., Bonifacio, E., Saeger, H. D., Solimena, M. Impaired insulin turnover in islets from type 2 diabetic patients. Islets. 2, 30-36 (2010).
- Hardt, P. D., Brendel, M. D., Kloer, H. U., Bretzel, R. G. Is pancreatic diabetes (type 3c diabetes) underdiagnosed and misdiagnosed?. Diabetes Care. 31, S165-S169 (2008).
- Meisterfeld, R., Ehehalt, F., Saeger, H. D., Solimena, M. Pancreatic disorders and diabetes mellitus. Exp Clin Endocrinol Diabetes. 116, S7-S12 (2008).
- Verge, C. F., Gianani, R., Kawasaki, E., Yu, L., Pietropaolo, M., Jackson, R. A., Chase, H. P., Eisenbarth, G. S. Prediction of type I diabetes in first-degree relatives using a combination of insulin, GAD, and ICA512bdc/IA-2 autoantibodies. Diabetes. 45, 926-933 (1996).
- Alberti, K. G., Zimmet, P. Z. Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications. Part 1: diagnosis and classification of diabetes mellitus provisional report of a WHO consultation. Diabet Med. 15, 539-553 (1998).
- Marselli, L., Thorne, J., Ahn, Y. B., Omer, A. Gene Expression of Purified {beta}-Cell Tissue Obtained from Human Pancreas with Laser Capture Microdissection. Journal of Clin. Endocrinol. Metab. 93, 1046-1053 (2008).
