siRNA 전달을위한 셀 타입의 특정 안티 HIV gp120 aptamers의 개발
Summary
nanomole 친화력과 HIV – 1Ba – L gp120에 대한 몇 가지 2' – 플루오로 RNA의 aptamers는 RNA 라이브러리에서에 의해 고립 아르<em> 체외에서</em> SELEX 절차. 키메라 새로운 듀얼 억제 기능을 방지 gp120 aptamer – siRNA가 생성되고 체계적 안티 HIV 치료를위한 상당한 약속을 보여줍니다.
Abstract
HIV 감염의 글로벌 전염병은 antiretroviral 대리인의 새로운 클래스를위한 긴급한 필요를 만들었습니다. 보완 RNA의 성적 표현을 억제하는 작은 간섭 (SI) RNAS의 강력한 기능은 HIV를 포함하여 질병의 다양한 치료제의 새로운 클래스로 악용되고있다. 많은 이전의 보고서 소설 RNAi 기반 anti-HIV/AIDS 치료 전략이 상당한 약속을하는 것으로 나타났습니다, 그러나, 성공적인 치료 응용 프로그램과 siRNAs의 임상 번역에 대한 주요 장애물은 효율적으로 전달됩니다. 특히, RNAi 기반 치료제의 안전성과 효능을 고려하여, 그것은 특정 세포 집단 또는 조직에 타겟 세포 siRNA 전달 방법을 개발하기 위해 매우 바람직합니다. HIV – 1 gp120 단백질, HIV – 1의 표면에 당단백질 봉투는 CD4 세포에 바이러스 항목에 중요한 역할을합니다. HIV – 1 항목을 촉발 요인과 세포 융합을 시작 것을 gp120과 CD4의 상호 작용은 약물 발견을위한 임상 관련 안티 바이러스 전략으로 검증되었습니다.
여기에, 우리는 첫째로 2' – F 수정된 안티 HIV gp120 RNA의 aptamers의 선택과 신분증을 토론합니다. 종래의 nitrocellulose 필터 SELEX 방법을 사용 nanomolar 친화력과 함께 여러 가지 새로운 aptamers는 50 무작위 NT RNA 라이브러리에서 고립되었다. 성공적으로 높은 친화력과 바운드 종 얻기 위해서는, 선택의 엄중는 신중하게 조건을 조정하여 제어됩니다. 선택한 aptamers은 특별히 바인딩할 수 있고 빠르게 HIV – 1 봉투 단백질을 표현하는 세포로 internalized 수 있습니다. 또한, 혼자 aptamers는 HIV – 1 감염을 중화시킬 수 있습니다. 최고의 aptamer A – 1을 기반으로, 우리는 aptamer와 siRNA의 부분이 모두 강력한 항정 HIV 활동을 갖고있는 키메라 소설 이중 억제 기능을 방지 gp120 aptamer – siRNA를 만듭니다. 또한, 우리는 HIV – 1 감염 세포에 siRNA의 세포 유형 특정 배달 gp120 aptamer – siRNA의 chimeras를 활용. 키메라이 듀얼 기능은, 억제 HIV – 1 감염의 다양한 핵산 치료 요원 (aptamer와 siRNA) 결합 매우 적극적인 antiretroviral 치료 (HAART)을 실패한 환자에 대한 aptamer – siRNA의 chimeras에게 매력적인 치료 후보를 만들기위한 상당한 잠재력을 보여줍니다.
Protocol
Discussion
관내는 따라서 타겟 분자 8 매우 구체적이고 꽉 바인딩을 제공하고, 구체적이고 안정 입체 형태를 가정 핵산을 진화에 Aptamers 있습니다. 낮은 nanomolar 구속력 친화력과 목표를 aptamers의 절묘한 특이성은 생체내 이미징 및 치료제 9, 진단을 위해 다양한 도구를합니다. 타겟 siRNA 전달을위한 aptamer 기술의 도래와 함께 이제 siRNAs 10-12의 수용체 매개 end…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 브리타 휸, Guihua 일, 해리스 Soifer 및 도움이 토론에 대한 리사 쉐러 감사합니다. CHO – EE 및 CHO – gp160 셀 :이 작품은 NIH AIDS 연구 및 참조 시약 프로그램, AIDS 학부, NIAID, NIH를 통해 얻은되었습니다 보건 AI29329 다음과 같은 시약을 JJR에게 수여 HL07470 국립 연구소에서 보조금에 의해 지원되었다 라인, pNL4 – 3 륙 벡터, DAIDS, NIAID에서 HIV – 1 gp120 발.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| MF-Millipore membrane filter | Millipore | HAWP01300 | Pore size 0.45 μm |
| Swinnex Filter holder | Millipore | SX0001300 | 13 mm diameter |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28706 | DNA purification |
| Microcon YM-30 column | Millipore | 42410 | RNA concentration |
| Bio-spin 30 column | Bio-Rad | 732-6250 | RNA purification |
| Taq PCR DNA polymerase | Sigma-Aldrich | D1806 | |
| ThermoScript RT-PCR system | Invitrogen | 11146-024 | |
| DuraScribe T7 transcription Kit | EpiCentre | DS010925 | |
| dNTP for PCR | Roche | 1 581 295 | |
| Ribonucleic acid, transfer from E.coli | Sigma-Aldrich | R1753 | tRNA competitor |
| HIV-1Ba-L gp120 protein | the AIDS Research and Reference Reagent Program | 4961 | Target protein |
| Silencer siRNA labeling kit – Cy3 | Ambion | 1632 | |
| Acid phenol/chloroform 5/1 solution (pH 4.5) | Ambion | AM9720 | |
| Chloroform/Isopropanol 24/1 solution | Sigma | C0549 | |
| Calf intestinal phosphatase (CIP) | New England BioLab | M0290L | |
| T4 polynucleotide kinase | New England BioLab | M0201L | |
| Glycogen | Roche | 10 901 393 001 | RNA precipitation |
| Gamma-P32-ATP | MP Biomedical | 013502002 | Radiactivity |
| 40% AccuGel 19:1 | National Diagnostics | EC-850 | |
| 10xTBE | National Diagnostics | EC-860 | |
| N,N,N,N’-Tetramethylethylenediamine (TMEMD) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| L-methioine sulfoximine | Sigma-Aldrich | M5379-250 mg | |
| RPMI Media 1640 | Invitrogen | 11835-030 | |
| Sodium Bicarbonate solution, 7.5% w/v | Invitrogen | 25080-094 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) (10) | Invitrogen | 11430-030 | |
| MEM non-essential amino acid (100) | Invitrogen | 11140-050 | |
| TA cloning kit with pCR 2.1 | Invitrogen | K2040-01 |
References
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