1. Determinare l'intervallo di concentrazioni mutageno che è minimamente tossico per le cellule Lo scopo di questo esercizio è quello di determinare quale intervallo di concentrazioni mutageni può essere usato durante l'infezione senza tossicità delle cellule in eccesso. In sostanza, si vuole riprodurre le condizioni che saranno necessari per l'infezione da virus. Per la maggior parte dei virus, infezioni scorso tra i 2 ei 7 giorni. Preparare piatti abbastanza per le cellule del campione in ogni giorno. Se non aderente cellule sono utilizzate, modificare il protocollo di conseguenza. Il giorno prima dell'esperimento, semi di 7 x 10 5 cellule HeLa / bene in un 6-pozzetti che ottengono un sub-confluenti (75%) monostrato il giorno dell'esperimento. Ciascun pozzetto della piastra saranno trattati con una concentrazione diversa di mutageni, consentendo una gamma di 6 concentrazioni. Il giorno dell'esperimento, preparare diluizioni mutageno nei terreni di coltura. Per le cellule HeLa, utilizzare una gamma da 0 a 1000 mM per analoghi base (ribavirina, 5-fluorouracile, 5-azacitidina), da 0 a 50 mm per MgCl 2, e da 0 a 5 mm per MnCl 2. Aspirare il terreno dai pozzetti e sostituire con 2 ml mutageno-integrato medie e tornare alla incubatrice. Ogni 24 ore, utilizzare una piastra di cellule per controllare la vitalità cellulare. Questo può essere eseguita mediante colorazione blu trypan o utilizzando commercializzato fluorescenza / luminescenza test (ad esempio Promega di CellTiter-Glo ® luminescenti saggio vitalità cellulare). Per la colorazione blu trypan esclusione, staccare le cellule da un piatto (trattate con diverse concentrazioni di mutageni) e delicatamente le cellule pellet per centrifugazione. Eliminare le cellule surnatante e risospendere in PBS (siero può interferire con colorazione). Mescolare 1 volume di sospensione cellulare in PBS con 1 volume del 0,4% trypan blu, incubare per 2 minuti a temperatura ambiente. In un emocitometro, contare le vitali (senza macchia) e non vitali (blu colorato) cellule. Calcolare la percentuale di cellule vitali per ciascuna concentrazione del mutageno, tra cui il controllo non trattato. Troviamo che condizioni che portano a meno del 50% la morte cellulare dall'endpoint infezione (quando titoli massime vengono raggiunte) sono ideali per l'isolamento di resistenza mutagene. 2. Determinare la concentrazione ottimale non mutageno tossico che riduce moderatamente titoli virus (circa 0,5-2 riduzione logaritmica) Questo esercizio serve a determinare la concentrazione del mutageno che esercitano una forte pressione selettiva, senza troppo mutagenizing della popolazione. Per RNA mutageni, troviamo che questo corrisponde a 10,5-2 log riduzioni del titolo virus. A queste concentrazioni, ogni genoma è mutato in almeno una o due posizioni. Il mutageno può aiutare nella generazione della mutazione resistenza, che saranno poi selezionati oltre passaggio. Se le mutazioni troppi sono introdotti (ad altissima concentrazione mutageno), i mutanti portante la mutazione di resistenza a loro volta avranno letale mutagenizzate, impedendo il loro isolamento. Piatti di semi con le cellule utilizzando le stesse condizioni per il passaggio 1 Il giorno dell'esperimento, preparare diluizioni mutageno nei terreni di coltura. Utilizzare la stessa gamma di concentrazione come sopra determinato, ma escludono le concentrazioni che hanno causato la morte delle cellule del 50%. Preparare abbastanza medium per coprire ogni ben due volte (4 ml per pozzetto), consentendo un pre-trattamento di cellule prima dell'infezione, con ogni concentrazione del mutageno. Aspirare le cellule medie e pretrattare con mutageni con incubazione in mutageno-integrati media per 2 ore. Per la maggior parte dei tipi di cellule, questo è il tempo necessario per l'assorbimento del mutageno. Rimuovere medie e infettare con virus a bassa molteplicità di infezione MOI (0,1 o 0,01) in un volume minimo (200 microlitri per 6-pozzetti). Incubare per 15-60 minuti per permettere al virus di infettare le cellule. La piastra di roccia a intervalli regolari per garantire che l'inoculo copre il monostrato cellulare. Aspirare il virus inoculato e lavare due volte con 2 ml di PBS per rimuovere la maggior quantità di inoculo possibile. Aggiungere mezzo con le concentrazioni adeguate di cellule mutagene ad ogni pozzetto e incubare per l'equivalente di 3-6 cicli di replica. Virus raccolta da ciascun pozzetto e determinare l'effetto antivirale sul titolo virus. Questo può essere fatto mediante test placca standard o la limitazione di diluizione (TCID 50). Nota: Quantificazione del virus con tecniche che misurano solo la sintesi di RNA può non essere adatto perché gli effetti mutageni potrebbe non essere rilevato. Genomi mutagenizzate contenenti mutazioni letali può ancora essere rilevato da qRT-PCR per esempio, ma non sarebbe osservato nei saggi vitalità del virus. Dai titoli calcolato, identificare la concentrazione del mutageno che riduce titoli virus (rispetto al controllo delle infezioni non trattate) da 10,5-2 registri che è anche non altamente tossico per le cellule (in teoria, meno del 50% di tossicità). 3. Isolamento e identificazionezione delle varianti resistenti mutageno Eseguire grandi passaggi popolazione della concentrazione ottimale mutageno sopra definito e controllare titoli virus in tutta la serie passaggio. Come controllo, passaggio del virus nel terreno di coltura senza mutageno. Mentre un altro controllo per monitorare l'insorgere di potenziali difetti particelle interferenti (DI), eseguire nuove infezioni in assenza di mutageni ad ogni passo passaggio (controllo unpassaged). Il giorno prima dell'infezione, semi di 25 cm 2 palloni con 1,5 x 10 6 cellule HeLa (pallone di altre dimensioni possono essere usati) per ottenere sub-confluenti monostrati il giorno successivo. Il giorno del contagio, pretrattare le cellule per 2 ore con terreno contenente la concentrazione ottimale di ogni mutagena, determinato al punto 2. Rimuovere medie e infettare le cellule con un volume minimo ad un MOI di 1 o il più grande MOI che non si traduca in difetto interferenti (DI) la formazione di particelle per il virus in fase di studio. Dopo 30-60 minuti di infezione, aspirare l'inoculo e lavare due volte con PBS, quindi aggiungere mezzo fresco integrato con mutageni sul concentrazioni appropriate. Incubare per il periodo di tempo determinato nelle sezioni 1 e 2 che corrisponde al titolo del virus massimo in queste condizioni. Raccolto il virus progenie. Virus titolo ad ogni passaggio e ripetere i 3 passaggi precedenti. Durante i primi passaggi, i titoli di campioni del virus mutageno trattati dovrebbe scendere di conseguenza, rispetto al titolo originale del virus e il controllo (non trattato e unpassaged) titoli virus. Se il titolo del virus del mutageno con diversi passaggi campioni risalire agli stessi livelli del controllo non trattato, la popolazione contiene probabilmente una variante resistente mutageno. Fino a 20 o 30 passaggi possono essere richiesti, anche se abbiamo isolato la maggior parte della nostra fedeltà varianti tra 5 e 15 passaggi. Una volta che i titoli di virus per una serie passaggio dato raggiungere la stessa grandezza come i titoli di controllo non trattato, estratto di RNA da tutti i campioni compreso il controllo non trattato dal numero stesso passaggio. Kit di estrazione RNA o di estrazione Trizol può essere utilizzato. Eseguire la RT-PCR utilizzando primers che amplificano i geni della polimerasi o replicasi del virus di interesse. In una seconda fase, l'intero genoma (almeno regioni codificanti) dovrebbe essere sequenziato per verificare se fenotipi di resistenza mappa per i geni del virus anche altri. Ciò è particolarmente importante per le sostanze mutagene di base analogica, come la ribavirina, che colpisce gli altri aspetti del virus e la funzione delle cellule. In questo caso la variante può essere resistente ad una di queste altre attività antivirale e non sarà una variante fedeltà. Purificare la RT-PCR prodotti utilizzando un kit di purificazione PCR e la sequenza per ottenere il mutageno resistente sequenza consenso della popolazione. Includono i controlli di fondo per l'errore di sequenziamento (vedi Discussione). Utilizzando un software di allineamento di sequenza e la sequenza consenso virus come riferimento, allineare le sequenze. Identificare le mutazioni nuovo punto, con particolare attenzione a quelle che compaiono esclusivamente nella popolazione trattata mutageno al passaggio in cui i titoli del virus raggiunge livelli normali. Se questa mutazione non è presente nei passaggi precedenti e non presenti nei controlli non trattati dal numero stesso passaggio (indicando adattamento al passaggio coltura cellulare), questa mutazione è probabilmente responsabile, almeno in parte, per la resistenza mutagene. Non fare affidamento su base chiamata sequenza (la versione testo della sequenza) e il software di allineamento da solo. Controllare i cromatogrammi per i picchi di minoranza che potrebbe essere stato perso da un software di allineamento. Un mutante che rappresenta il 20-30% della popolazione totale mostrerà ancora come un picco, ma troppo piccolo per essere identificato come un 'N' di analisi di sequenza standard. 4. Una volta che una mutazione è stata identificata, isolare o generare la variante e confermare il fenotipo di resistenza a diversi agenti mutageni RNA Successivamente, la variante che presenta la mutazione identificata è isolato per confermare il suo legame con il fenotipo di resistenza. E 'essenziale che la mutazione sospettato di cambiare fedeltà è studiato in uno sfondo pulito geneticamente (cioè, non presenta ulteriori mutazioni in altre parti del genoma). Nella migliore delle situazioni, un clone infettivo cDNA esiste che avrebbe permesso la generazione di uno stock di mutageno resistente variante di mutagenesi sito-specifica su uno sfondo pulito genetica. In questo caso, la sezione 4 non è necessario. Tuttavia, se un clone cDNA non è disponibile, l'isolamento può essere fatto da purificazione placca di virus, descritto di seguito. Più di un round di purificazione della placca può essere richiesto per isolare la variante su una superficie pulita, background genetico. Isolamento dei mutanti resistenti mutageno mediante test placca. Per isolare il mutante identificato, eseguire un test standard di placca sotto agarosio (0,5 a 1% finale in peso / vol) overlay in 6 pozzetti. Preparare diluizioni seriali del virus, sulla base dei titoli magazzino, a dilutions che produrranno tra 10 e 50 ben separati placche. Quando le placche sono ben visibili (di solito 2 a 5 giorni dopo l'infezione, a seconda del virus), contrassegnare la posizione delle placche sulle piastre e con una pipetta P200 con punta filtro, immergere delicatamente la punta attraverso la sovrapposizione di agarosio facendo attenzione a non rimuovere e spostare la posizione del overlay (che comporterebbe la contaminazione crociata di placche individuali). Sollevare con cautela la punta fuori della sovrapposizione e trasferire la spina agarosio contenute nella punta di un eppendorf contenente 250 ml di medie e vortice. Non preoccupatevi se la punta che viene rimosso non contiene agarosio, per molti virus a RNA, una placca media per molti virus a RNA contiene 10 5 virus e una quantità sufficiente sarà trasferito semplicemente toccando la punta verso la superficie della placca. Raccogliere fino a 10 targhe per ogni trattamento mutageno. A seconda del cromatogrammi di sequenziamento che ha identificato la mutazione, stima circa la percentuale di popolazione contenente la mutazione desiderata. L'obiettivo è quello di isolare tre o quattro placche con la mutazione. Alcuni di questi mutanti anche portare ulteriori mutazioni indesiderate, che sarà poi identificato mediante sequenziamento. Estrarre l'RNA da questi campioni (ma salvare la metà del campione per fare un magazzino più grande del virus) ed eseguire RT-PCR che permetterà il sequenziamento dell'intero genoma. In media, i virus a RNA conterrà fino a due differenze mutazionale rispetto alla sequenza consenso, quindi, sequenza di 3 o 4 placca purificata virus in un momento di identificare l'isolato che contiene la mutazione desiderata senza mutazioni aggiuntivi. Una volta identificato, fare una scorta più grande di questo virus per tutti gli studi a valle, con il campione di placca purificata ottenuta in precedenza per infettare un pallone più grande di cellule, ad esempio 8×10 6 cellule HeLa in un pallone T75 .. Confermare la sensibilità mutageno / resistenza conferito dalla mutazione identificata. Utilizzando il clone isolato o appena generato, e un virus selvaggio controllo di tipo prodotta in condizioni analoghe, ripetere gli esperimenti nella sezione 2 utilizzando una gamma completa di concentrazioni mutageno, o la concentrazione alla quale è stata generata la mutazione di resistenza. Utilizzare diverse condizioni RNA mutageno (ribavirina, 5-fluorouracile, 5-azacitidina, una maggiore Mg 2 +, Mn 2 +). Se la variante polimerasi è resistente a più di un tipo di mutageni, allora è più probabile che questa variante è alta fedeltà. In alternativa, è possibile che una mutazione di resistenza è specifica per una singola condizione mutageno, soprattutto perché alcuni di questi composti influenzano virus RNA attraverso una serie di meccanismi di 8. 5. Controllate le tariffe replica Dal momento che la fedeltà che alterano le mutazioni più spesso della mappa per la polimerasi, è possibile che la mutazione polimerasi stessa alterare in modo significativo cinetica replica ed è importante per stabilire somiglianze e differenze nella replica che permetterà un miglior confronto tra differenze nella frequenza di mutazione eseguiti sotto. Per fare questo, esamina replica da almeno due approcci complementari – quella che prende in esame la produzione del virus e un altro che prende in esame la sintesi di RNA. One-step virus crescita cinetica Il giorno prima dell'esperimento, seme di 6 pozzetti, se necessario, un piatto per ogni punto di tempo per essere testati. Considerare l'utilizzo di pozzi tripla per ogni mutante e il virus wild-type. Il giorno dell'esperimento, rimuovere il terreno e infettare i pozzi con ogni virus con una MOI di 10 per garantire che ogni cellula è infettata simultaneamente. Incubare per 30-60 minuti a 37 ° C. Roccia piastre ogni 10 minuti per evitare l'essiccamento del monostrato cellulare. Rimuovere virus e lavare due volte con 2 ml di PBS. E 'importante rimuovere la maggior quantità di inoculo possibile. Sostituire con mezzo di crescita. A seguito di infezione al tempo = 0, raccogliere il virus da un piatto. Ritorna piastre incubatore e raccogliere i virus a intervalli regolari che comprendono un singolo ciclo di replica (ad esempio per 3h, 5h, 7h, 9h, 12h, 24h). Titolo di virus, raccolte in ogni momento (ad esempio test di placca, TCID50, saggio FFU), e rappresentare graficamente le curve di crescita del titolo in funzione del tempo. Cinetica della sintesi di RNA La cinetica della sintesi di RNA può essere monitorato utilizzando uno dei metodi indicati di seguito. Se possibile, gli stessi campioni usati per determinare one-step cinetica di crescita dovrebbe essere usato per misurare i livelli di RNA. qRT-PCR. Questa procedura dà misure altamente quantitativa di replica su una vasta gamma, da un paio di copie del genoma> 10 10, a seconda della sensibilità del test. Primer design e le sonde che coprono un piccolo frammento (<200 bp) di una regione altamente conservata del genoma. </li> Northern blot analisi. Anche se meno quantitativo di qRT-PCR, questa tecnica permette la conferma visiva che si traduce in replica full-length genomi e che non interruzione della catena significativo si verifica a causa della mutazione polimerasi. Espressione di un gene reporter. Se un clone cDNA che esprime un gene reporter (luciferasi ad esempio) è disponibile, allora questo può essere utilizzato come un surrogato per esaminare la capacità replicativa. Tuttavia, il virus ricombinante non deve essere utilizzato per altre applicazioni (quali la determinazione della frequenza di mutazione) in quanto le pressioni selettive che agiscono per questo virus non sarà più la stessa, in particolare perché questi virus hanno la tendenza a eliminare il gene reporter inserito. 6. Misura mutazione frequenze Questo è un passo fondamentale nel confermare che la mutazione identificata polimerasi che conferiscono resistenza alla replica fedeltà mutageno altera. E 'importante notare che le frequenze di mutazione misurato qui non sono i tassi di mutazione. Per determinare le tariffe, una misura molto accurata della cinetica di replicazione (quantità di RNA sintetizzato e la lunghezza del ciclo di replicazione) deve essere preso in considerazione in misura frequenze di mutazione però, fino a quando la storia replica passaggio e cinetica sono monitorati, fornisce riproducibile, misure quantitative di replica fedeltà. Frequenze di mutazione può essere determinato nella popolazione virus vitale (cloni placca o diluizione limite) o virus nella popolazione totale (stock virus o surnatante). Per determinare le frequenze di mutazione, preparare le riserve di virus da un passaggio successivo (ad esempio il passaggio 2 o oltre). E 'importante che la popolazione virus ha avuto il tempo di espandere la propria diversità genetica più vicino a una mutazione-selezione equilibrio. Frequenze di mutazione del virus vitale popolazione Questo approccio, anche se più laboriosa, dà informazioni su quante mutazioni siano presenti nel genoma media che mantiene la competenza di replica. Va notato, tuttavia, che un pregiudizio per le varianti di fitness più elevato si verifica e inferiore fitness, varianti vitale che non facilmente targa, per esempio, può non essere rilevato. Come tale, essa permette anche una migliore misure di sinonimi (DS) e non sinonimo (DN) sostituzioni nucleotidiche che può essere utilizzato per esplorare se la selezione positiva agisce sulla popolazione. Tuttavia, poiché un minor numero di mutazioni saranno quantificati, un maggior numero di sequenze saranno necessari per l'analisi statistica. Questa tecnica si basa sull'isolamento del virus da una purificazione individuale placca o diluizione limitante, come descritto sopra. Come punto di partenza, si consiglia di isolamento di 48 singoli "cloni" del virus wild-type e la mutageno resistente variante. Ogni popolazione clonale isolati in questo modo si prevede di effettuare qualsiasi mutazione del genoma fondatore presentati. La quantità di RNA presenti nella placca isolata o limitare la diluizione è generalmente sufficiente anche per l'amplificazione mediante RT-PCR. Se necessario, una amplificazione breve (meno di un ciclo di replica) su un numero minimo di cellule (ad esempio formato 24 pozzetti) può essere utilizzato per ottenere più RNA, tuttavia, l'amplificazione minima dovrebbe essere eseguita per evitare l'accumulo di nuove mutazioni. Si noti che ogni clone e la popolazione da confrontare devono subire lo stesso numero di cicli di replica. Isolare 24-48 cloni virus purificazione placca o diluizione limitante. Estrarre l'RNA da popolazioni isolate clonale RT-PCR amplifica un frammento che copre fino a 3kb per ogni campione. E 'meglio coprire la regione proteina strutturale, che tende a tollerare le mutazioni più attivi rispetto regioni più conservate di geni non strutturali. Purificare la PCR prodotti, la sequenza ed eseguire analisi di mutazione (sezione 7). Frequenze di mutazione del virus della popolazione totale Nonostante un vantaggio di questo secondo metodo è che anche le varianti di fitness bassi saranno inclusi nella sequenza, permettendo un quadro più ampio dello spettro di mutazioni. Tuttavia, non può essere l'ideale per le analisi filogenetica che assumono le popolazioni virus vitale (ad esempio dN / dS valori) e l'identificazione delle mutazioni più rilevanti, dal momento che i cambiamenti letale (alterato RNA struttura, codoni di stop, drammatici cambiamenti di aminoacidi) non possono essere interamente identificato e sarebbe mantenuto nell'analisi. Tuttavia, questa tecnica permette al ricercatore di ottenere i dati più statisticamente significativo per confermare l'alterazione di fedeltà quando vi è una mancanza di un test in vitro biochimici. Questa tecnica si basa su RT-PCR l'amplificazione di RNA totale virione, tra cui genomi a basso-fitness o mutazioni letali che non producono placche. Le frequenze di mutazione ottenuti con questo metodo possono essere 10 volte più alta rispetto dalla placca o limitando la clonazione di diluizione. Estrarre l'RNA da parte della popolazione totale virione RT-PCR amplify uno 800-1200 regione nucleotide da una parte della sequenza genomica di codifica che è noto a tollerare mutazioni e hanno varianza genetica (ad esempio proteine strutturali). Frammenti più grandi non si inserisce facilmente in vettori di clonazione come TopoTA e produrrà un numero insufficiente di trasformanti. Sebbene frammenti più piccoli sono ancora meglio, la copertura del genoma sequenziato potrebbe essere troppo poco per ottenere una significatività statistica. Un frammento di almeno 800 bp permette la copertura sequenza con due primer ed è un buon compromesso tra la massimizzazione copertura sequenza e minimizzare i costi di sequenziamento. Troviamo che tra 70 e 100 sequenze che copre una regione 800 nucleotidi conferma riproducibile alterato la fedeltà delle varianti che abbiamo studiato in laboratorio. Da notare che altri vettori / clonazione metodi possono essere utilizzati con uguale efficacia. Purificare la RT-PCR prodotto utilizzando un kit commerciale o per estrazione di DNA standard / precipitazioni. Se l'RT-PCR si utilizza enzimi non producono un strapiombi, eseguire una estensione 10 minuti con l'aggiunta di 1 mM ATP e Taq polimerasi TopoTA clone seguendo le istruzioni del produttore Per ogni popolazione del virus da studiare, selezionare 96 colonie, identificate come aventi un inserto positivo blu / bianco di screening su XGal piastre rivestite. Inizialmente, prova la presenza di inserti per ogni regione del genoma diverso di essere clonato, a confermare la validità del blu / bianco di screening con lo screening dimensioni plasmide su gel di agarosio o singola colonia PCR. Utilizzando la dimensione del frammento e le condizioni di cui sopra, abbiamo il 90% positivi Crescere ogni colonia in brodo di liquidi durante la notte in 1 ml di terreno LB in 96 piastre di coltura batterica bene Il giorno dopo preparare minipreps in formato a 96 pozzetti. Sequenza ogni piatto con primer a sufficienza (i primer utilizzati per la RT-PCR per esempio, o TopoTA primer M13) per ottenere la massima copertura del segmento clonato. Effettuare analisi di mutazione (sezione 7). 7. Analisi di sequenze Effettuare analisi di sequenza utilizzando un riferimento o una sequenza consenso per ogni popolazione e il software corretto allineamento. Si consiglia di Lasergene Sequencher o che possono facilmente identificare SNP rispetto al consenso. Allineare le sequenze utilizzando un software appropriato (per esempio Lasergene o Sequencher). Eliminare le sequenze di scarsa qualità (chiamata base di male, troppi 'N o troppo breve di lunghezza). Identificare la gamma di nucleotidi che è coperta da tutte le sequenze. Dal momento che diverse regioni del genoma sarà più o meno tollerare le mutazioni, per motivi di confronto è essenziale che la stessa regione è completamente coperto per ogni clone sequenziato mantenuto per l'analisi. Quindi, se le reazioni sono diverse sequenze eseguite per ogni clone, e una sequenza non riesce per un clone dato, scartare il clone (tutte le sequenze) dall'analisi. Identificare e contare le SNPs che sono diverse dal ceppo di riferimento. Calcolare la frequenza di mutazione dividendo il numero totale di SNPs identificati dal numero totale di nucleotidi in sequenza (numero di lunghezza x cloni della regione in sequenza). Presentando questo numero come numero medio di mutazioni per 10K nt sequenziato rende il numero più user-friendly poi lasciandola secondo nucleotide. Ad esempio, per la popolazione di tipo selvatico nella tabella 1, 55 mutations/121, 978 nucleotidi totale x 10.000 = 4,51 mutazioni per 10.000 nucleotidi in sequenza. Se lo stesso SNP appare su un gran numero di cloni, presenti due valori che includono o escludono queste mutazioni ripetuto. In generale, per una popolazione di virus prodotto da un genitore omogenea (da purificazione placca o da un clone infettivo) e diversi passaggi solo poche volte in coltura cellulare, selezione positiva non ha esercitato i suoi effetti sufficiente a provocare l'accumulo degli stessi SNP e la mutazione valori di frequenza misurata in questo modo riflettono meglio la frequenza di errore della polimerasi, con effetti minimi di selezione positiva o purificante. Determinare la distribuzione mutazione. Fare una graduatoria del numero di cloni in ciascuna popolazione che presentano 0, 1, 2, 3, ecc .. mutazioni nella regione sequenziato. Calcolare la diversità della popolazione virale in confronto a coppie distanza. Dal puliti e sequenze modificate manualmente preparare un allineamento tra la regione di riferimento. Ci sono programmi di allineamento disponibili diversi: CLUSTALW / X ( http://www.clustal.org/ ), MUSCOLO ( http://www.drive5.com/muscle/ ), EbioX per gli utenti Mac ( http://www. ebioinformatics.org / ebiox / ), ecc Assicurarsi che tutte le sequenze sono della stessa lunghezza, il raccolto, se necessario. Si raccomanda che l'inizio delle sequenze è un codone codifica per facilitare l'analisi posteriore. Si consiglia di tenere tutti gli allineamenti in formato FASTA, che è facilmente leggibile dalla maggior parte dei software disponibili. <li> Per eseguire l'analisi a coppie a distanza, calcolare tutti i possibili confronti a coppie tra le sequenze appartenenti alla stessa popolazione. Mutazioni media trovati nei confronti può essere calcolato per indicare l'eterogeneità della popolazione. Valori per sinonimo (dS) e non sinonimo (DN) all'interno della popolazione può essere facilmente ottenuto. Troviamo il software MEGA (http://www.megasoftware.net/) utile e facile da usare per questo tipo di analisi. Per ottenere Selezione della direzione che diamo due possibilità anche se non sono gli unici possibili. 1) Ottenere il rapporto tra dN e DS. Valori superiori a 1 significano selezione positiva. Valori inferiori a 1 significano selezione purificatrice. 2) Utilizzare il webserver Datamonkey ( http://www.datamonkey.org/ ). Carica il tuo allineamenti in formato FASTA e analizzarli con il modulo SLAC. Questo vi darà una stima di dN / dS. Effettuare analisi statistiche. A seconda della quantità di dati e numero di sequenze, una serie di test può essere utilizzato. Alcuni studi si sono basati su test chi quadrato del numero totale di mutazioni rispetto al numero totale di nucleotidi consenso in cui si combinano tutti i cloni 9. Altri studi hanno eseguito i test esatto di Fisher, calcolato sul numero di sequenze che presentano mutazioni rispetto al numero di sequenze senza mutazioni 10. Se un numero sufficiente di dati mutazionale è generato, si consiglia di eseguire un test classificato tale somma come Mann Whitney U. Per farlo, rango il numero di cloni in ogni popolazione del virus in base al numero di mutazioni presenti su ogni sequenza di RNA. Il Whitney Mann poi verificare le differenze nella distribuzione mutazione delle popolazioni. Per questo motivo, si consiglia di sequenziamento di almeno 800 paia di basi, per aumentare la probabilità di trovare cloni con mutazioni multiple. Questo test è robusto, ma richiede campioni di dimensioni più grandi. D'altra parte, non richiede la stessa dimensione del campione per le due popolazioni a confronto (ad esempio, i campioni da tabella 1 sono n 1 = 148 e n 2 = 84). 8. Rappresentante dei risultati: L'effetto dose-dipendente della concentrazione mutageno sulla vitalità cellulare e la vitalità del virus è mostrata in Figura 1. In questo esempio, abbiamo scoperto che il passaggio del virus in 100 mM AZC è stata ridotta a titolo di virus dal mirati 10,5-2 registro, ma la vitalità delle cellule HeLa è stato Non negativamente durante i 2 giorni necessari per l'infezione da virus. Questo esperimento pilota ha portato alla scelta di 100 concentrazione mM AZC per il passaggio di serie del virus, per selezionare la resistenza mutagene. La figura 2 illustra una riduzione iniziale del titolo, seguita da comparsa di un fenotipo di resistenza mutageno. Durante i primi passaggi in mutageno, come si accumulano le mutazioni letali, un calo significativo in titoli del virus si verifica. A poco a poco, un agente mutageno resistente variante emerge una sua comparsa coincide con un ritorno alla titoli virus non è diverso da controlli non trattati. In questa fase, una grande percentuale della popolazione virus presenta la mutazione di resistenza. Sequenziamento di questa popolazione virus rivela il cambiamento aminoacido (s) responsabile. Una volta identificati e isolati o appena generato, il mutageno virus resistenti possono essere meno sensibili di tipo selvatico a differenti RNA mutageni (analoghi base della diversa struttura, per esempio). Figura 3 mostra un RNA mutageno resistente virus Coxsackie B3 che titoli superiori wild-type in presenza di ribavirina, 5-fluorouracile, e 5-azacitidina, e ad alta MgCl 2 e MnCl 2. Resistenza ampio RNA mutageni è un forte indicatore della fedeltà replica aumentato. Verifica che cinetica replica della variante fedeltà è simile al virus wild-type sarà di aiuto rispetto delle frequenze di mutazione. Figura 4 mostra la crescita di un passo-cinetica di una variante ad alta fedeltà rispetto al wild-type. Se i tassi di replica e titoli finali non sono simili, allora si dovrebbe provvedere a confrontare le popolazioni di virus di dimensioni simili, che hanno subito lo stesso numero di giri di replica. Il legame tra tasso di sintesi di RNA e la fedeltà di replica non è ben caratterizzato, in particolare in vivo. Un tasso di replicazione lenta può tradursi in una diminuzione della frequenza di mutazione (maggiore fedeltà), anche se questa non è una regola assoluta, come mostrato nella Figura 4. Con i parametri sopra stabilito, le frequenze di mutazione della variante fedeltà e le popolazioni wild-type può essere paragonata ad ottenere la conferma genetica della fedeltà replica alterato. Figura 5 mostra una sequenza di un allineamento di tipo selvatico e variante ad alta fedeltà, con mutazioni puntiformi identificate. Le mutazioni sono contati, classificati in base al numero di mutazioni per clone (Tabella 1), e rappresentata come una frequenza di mutazione medio per popolazione, per 10.000 nucleotidi in sequenza, Figura 6. <p class = "jove_content"> Figura 1. Determinare le condizioni ottimali per selezionare per la resistenza RNA mutageni:. Mantenimento della vitalità cellulare alta con un moderato (1-2 log calo del titolo del virus), le cellule HeLa sono state trattate con concentrazioni indicate di ribavirina e infettati con virus wild-type Coxsackie B3 ad una MOI di 0,01. 48 ore dopo l'infezione, il virus progenie è stato raccolto e titoli sono stati determinati da TCID 50. La percentuale di cellule che sopravvivono al trattamento dopo 48 ore, determinato dalla colorazione Blu tripano, è indicato sotto l'asse delle ascisse. I risultati mostrano che le concentrazioni di 100 e 200 micron ridurre titoli virus log 1-2, senza intaccare la vitalità cellulare. Figura 2. Passaggio seriale in presenza di concentrazioni moderate di RNA mutageni mutageno seleziona per le popolazioni resistenti. In questa figura, Chikungunya virus è stato diversi passaggi in cellule HeLa in presenza di mM ribavirina 50 (barre grigie). Passaggi di controllo sono state eseguite in assenza di ribavirina (barre nere). Dopo ogni passaggio, la progenie del virus è stata quantificata mediante saggio placca classica sulle cellule BHK. L'effetto mutageno è evidente durante i primi passaggi (P1 e P2 rispetto a p0 popolazione iniziale) dove il virus trattati calo i titoli di 2 log. Gradualmente, i titoli di ritorno alla normalità (non trattati) i livelli. Nessuna differenza significativa si osservano nel passaggio 5 popolazioni mutageno trattati rispetto ai non trattati, suggerendo che le varianti resistenti sono stati selezionati. Infatti, il sequenziamento del consenso della popolazione identificato mutazioni uniche del virus nella popolazione in trattamento ribavirina. Figura 3. Conferma di resistenza ampio RNA mutageni di struttura diversa. Mostrato qui, l'alta fedeltà A372V variante di virus Coxsackie B3 che è stata inizialmente isolata nella schermata descritto nella Sezione 3 è stato generato da un clone infettivo e testato per la sua sensibilità rispetto a diverse concentrazioni di diversi RNA mutageni (ribavirina, 5-fluorouracile, 5-azacitidina). Cellule HeLa sono state trattate con concentrazioni indicate di ribavirina e infettati con virus wild-type Coxsackie B3 ad una MOI di 0,01. 48 ore dopo l'infezione, il virus progenie è stato raccolto e titoli sono stati determinati da TCID 50. Qui sono i titoli di tipo selvatico (linee continue) e A372V variante (linee tratteggiate) in funzione della concentrazione mutagene. A372V titoli costantemente superiore a quello wild-type in tutte le condizioni testate. Figura 4. Tassi di replicazione e varianti fedeltà. Per determinare la one-step cinetica di crescita della produzione di virus, le cellule HeLa sono state infettate a MOI = 10 con entrambi i tipi selvatici (linea continua), ad alta fedeltà variante A372V (trattini lungo) o la variante di replica carente Cx64 (breve trattini) di virus Coxsackie B3. Nei punti di tempo indicato, la progenie del virus è stato raccolto da cellule e surnatanti di gelo-disgelo e titolati da TCID 50. L'aumento della fedeltà A372V non coincide con un difetto replica osservabile in coltura. La Cx64 variante presenta un significativo ritardo nella cinetica della replicazione e raggiunge al massimo i titoli che sono 1000 volte inferiore a quella del virus wild-type. Figura 5. Allineamento delle sequenze TopoTA clonato da ogni popolazione virus. Utilizzando l'approccio descritto nella sezione 7, ogni sequenza ottenuta da clonato RT-PCR prodotto è originario, presumibilmente da un singolo, unico nel genoma del virus della popolazione totale e sarebbe quindi, portatori di mutazioni uniche. La figura mostra un tipico allineamento, a seguito di pulizia di sequenze di scarsa qualità e la visualizzazione di SNP. L'SNP totale (10 in questa figura) all'interno di una popolazione sono contati, e il numero di SNPs che appaiono su ogni clone sono noti. Ad esempio, il clone sottolineata da una barra, contiene 2 mutazioni uniche mentre 8 altri cloni contengono un singolo, unico mutazione. Questi dati vengono utilizzati nella tabella 1. Per visualizzare una versione più grande di questa figura si prega di cliccare qui . Figura 6. Rappresentazione grafica delle frequenze di mutazione del virus popolazioni. Per facilitare l'interpretazione, i dati numerici ottenuti da sequenza e analisi statistiche possono essere rappresentati sia come grafico o un istogramma (qui). A372V virus genera un minor numero di mutazioni di tipo selvatico e presenta una frequenza di mutazione significativamente più bassa (*, p <0,01). La variante Cx64, che replica a titoli 1000-volte inferiore a quella di tipo selvaggio, presgenitori la stessa frequenza di mutazione (ns, non significativo) che indica che la velocità di replicazione e la fedeltà non sono necessariamente collegati. Lo stesso virus Chikungunya (CHIKV) popolazione dà frequenze di mutazione simile se lo stock di virus, o un 10 diluizione di 5 volte, è utilizzato per l'estrazione dell'RNA. Mutazione sintesi di distribuzione per l'analisi statistica. Nota: Per ogni clone, è essenziale che la regione genomica stesso (e la lunghezza della sequenza) è coperta. In questo caso, 859 nucleotidi per clone. Questo è fondamentale per le analisi statistiche. D'altra parte, i test somma dei ranghi utilizzata per l'analisi statistica non richiedono le dimensioni del campione a essere lo stesso, il ricercatore è libero di confrontare le popolazioni di diversa dimensione del campione. Quindi, i 142 cloni di tipo selvatico può essere paragonato al 84 cloni di A372V. # Cloni con mutazioni n tipo selvatico A372V 7 mutazioni 0 0 6 mutazioni 0 0 5 mutazioni 0 0 4 mutazioni 0 0 3 mutazioni 1 0 2 mutazioni 6 2 1 mutazioni 40 14 0 mutazioni 95 68 Mutazioni totale 55 18 Totale cloni sequenziati 142 84 Nucleotidi totale sequenziato 121.978 72.156 Mutations/10 4 nt 4,51 2,49 Tabella 1. . Distribuzione sintesi mutazione per l'analisi statistica Nota: Per ogni clone, è essenziale che la stessa regione genomica (e la durata della sequenza) è coperta. In questo caso, 859 nucleotidi per clone. Questo è fondamentale per le analisi statistiche. D'altra parte, i test somma dei ranghi utilizzata per l'analisi statistica non richiedono le dimensioni del campione a essere lo stesso, il ricercatore è libero di confrontare le popolazioni di diversa dimensione del campione. Quindi, i 142 cloni di tipo selvatico può essere paragonato al 84 cloni di A372V.
