بمعزل عن المتغيرات الاخلاص للفيروسات الحمض النووي الريبي وتوصيف التردد يتحور الفيروس

1. تحديد نطاق من تركيزات مطفر الحد الأدنى التي هي سامة للخلايا الغرض من هذه العملية هو تحديد ما يمكن أن تستخدم مجموعة من تركيزات مطفر خلال عدوى دون سمية الخلايا الزائدة. أساسا ، وسوف تحتاج إلى إعادة إنتاج الظروف التي ستكون لازمة لعدوى الفيروس. بالنسبة لمعظم الفيروسات والالتهابات الماضي بين 2 و 7 أيام. إعداد لوحات بما فيه الكفاية لعينة الخلايا في كل يوم. إذا تم استخدام الخلايا غير ملتصقة ، تعديل البروتوكول وفقا لذلك. في اليوم قبل التجربة ، وبذور 7 × 10 5 خلايا هيلا / جيد في لوحة 6 – جيدا ان تحقيق شبه متموجة (75 ٪) أحادي الطبقة يوم من التجربة. سيتم التعامل مع كل بئر من لوحة مع تركيز مختلفة من المغير ، والسماح مجموعة من 6 التركيزات. في يوم من التجربة ، وإعداد التخفيفات مطفر المتوسطة في زراعة الأنسجة. هيلا للخلايا ، واستخدام مجموعة من 0-1000 ميكرومتر النظير للقاعدة (ريبافيرين ، فلورويوراسيل 5 ، 5 – آزاسيتيدين) ، 0 إلى 50 ملم لMgCl 2 و 0-5 ملم لMnCl 2. نضح المتوسط ​​من الآبار واستبدالها مع 2 – المتوسطة مطفر تستكمل مل والعودة إلى الحاضنة. كل 24 ساعة ، استخدم واحد من الخلايا لوحة للتحقق من سلامة الخلية. ويمكن تحقيق ذلك من خلال أداء التريبان الأزرق أو التلوين باستخدام تجاريا مضان / التلألؤ المقايسات (على سبيل المثال في Promega CellTiter – GLO ® بقاء الخلية الانارة الفحص). لتلطيخ التريبان الاستبعاد الأزرق ، فصل الخلايا من لوحة (تعامل مع تركيزات مختلفة من المغير) وبلطف خلايا بيليه بواسطة الطرد المركزي. تجاهل الخلايا وطاف resuspend في برنامج تلفزيوني (المصل يمكن أن تتداخل مع تلوين). مزيج 1 تعليق حجم الخلايا في برنامج تلفزيوني مع 1 حجم 0.4 ٪ التريبان الأزرق واحتضان لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في عدادة الكريات ، عد قابلة للحياة (غير ملوثين) وغير قابل للحياة (الأزرق الملون) الخلايا. حساب النسبة المئوية للخلايا قابلة للحياة لكل تركيز المغير ، بما في ذلك مراقبة المعالجة. نجد أن الظروف التي تؤدي إلى أقل من 50 ٪ من موت الخلايا نقطة النهاية العدوى (عندما يتم التوصل إلى التتر كحد أقصى) مثالية لعزل المقاومة المغير. 2. تحديد الأمثل عدم تركيز مطفر السامة التي معتدل يقلل التتر فيروس (حوالي 0،5-2 الحد من السجل) هذا التمرين يساعد على تحديد تركيز مطفر التي من شأنها أن تمارس ضغوطا قوية انتقائية ، دون الإفراط في mutagenizing السكان. لالمطفرة RNA ، نجد أن هذا يتوافق مع تخفيضات في سجلات 10،5-2 عيار الفيروس. في هذه التركيزات ، وتحولت كل الجينوم في ما لا يقل عن واحد أو اثنين المواقف. المغير قد تساعد في توليد الطفرة المقاومة ، والتي سوف ثم يتم اختيار أكثر من المرور. إذا أدخلت تغيرات كثيرة جدا (مطفر بتركيزات عالية جدا) ، فإن المسوخ تحمل الطفرة المقاومة أنفسهم أن mutagenized القاتلة ، التي تعوق عزلتهم. لوحات البذور مع الخلايا باستخدام نفس الشروط للخطوة 1 في يوم من التجربة ، وإعداد التخفيفات مطفر المتوسطة في زراعة الأنسجة. استخدام نفس نطاق تركيزات كما هو محدد أعلاه ، ولكن يستبعد تركيزات التي أسفرت عن أكثر من 50 ٪ موت الخلية. تعد كافية لتغطية كل متوسطة جيدا مرتين (4 مل لكل بئر) ، مما يسمح لخلايا المعالجة قبل الإصابة ، مع تركيز كل المغير. نضح الخلايا المتوسطة ويمهد للمعالجة مع مطفر مطفر التي يحتضنها ، تستكمل المتوسطة لمدة 2 ساعة. لمعظم أنواع الخلايا ، وهذا هو الوقت الكافي لاستيعاب المغير. إزالة المتوسطة وإصابة بفيروس في تعدد منخفضة للعدوى وزارة الداخلية (0.1 أو 0.01) في مجلد والحد الأدنى (200 ميكرولتر لمدة 6 – جيدا لوحات). احتضان 15-60 دقيقة للسماح للفيروسات تصيب الخلايا. لوحة الصخور على فترات منتظمة لضمان أن يغطي اللقاح أحادي الطبقة الخلية. نضح الفيروس تلقيح ويغسل مرتين مع PBS 2 مل لإزالة أكبر قدر من اللقاح ممكن. إضافة المتوسطة مع التركيز المناسب للمطفر لكل الخلايا وكذلك لاحتضان ما يعادل تكرار دورات 3-6. فيروس الحصاد من كل بئر وتحديد تأثير مضاد للفيروسات على عيار الفيروس. ويمكن القيام بذلك عن طريق فحص اللوحة القياسية التخفيف أو الحد من (TCID 50). ملاحظة : تحديد كمية الفيروس عن طريق التقنيات التي توليف قياس الحمض النووي الريبي فقط قد لا تكون مناسبة لأنه قد لا يتم الكشف عن تأثيرات مطفرة. قد لا تزال تحتوي على جينومات Mutagenized الطفرات المميتة يمكن الكشف عنها بواسطة qRT – PCR على سبيل المثال ، ولكن لن يكون لوحظ في المقايسات بقاء الفيروس. من التتر محسوبة ، وتحديد تركيز المغير الذي يقلل من التتر فيروس (مقارنة مكافحة العدوى غير المعالجة) من قبل 10،5-2 السجلات التي هي أيضا ليست شديدة السمية للخلايا (مثالي ، وأقل سمية من 50 ٪). 3. العزلة وidentification من المتغيرات مطفر مقاومة أداء مقاطع كبيرة الحجم السكاني في تركيز مطفر الأمثل المحددة أعلاه والتحقق من التتر الفيروس عبر سلسلة من المرور. كعنصر تحكم ، وفيروس مرور في وسط النمو من دون أي المغير. كما تحكم آخر لرصد ظهور إمكانيات التدخل الجزيئات التالفة (DI) ، نفذ عدوى جديدة في غياب المغير في كل خطوة مرور (مراقبة unpassaged). في اليوم قبل 25 سم العدوى ، والبذور 2 القوارير مع 1.5 × 10 6 خلايا هيلا (يمكن استخدام أحجام قارورة أخرى) للحصول على شبه متموجة monolayers في اليوم التالي. في يوم من العدوى ، ويمهد للمعالجة الخلايا لمدة 2 ساعة مع المتوسط ​​تحتوي على تركيز الأمثل لكل المغير ، المحددة في المادة 2. إزالة المتوسط ​​وتصيب الخلايا مع حجم الحد الأدنى في وزارة الداخلية من 1 أو أكبر وزارة الداخلية التي لا تؤدي إلى خلل جسيم تشكيل التدخل (دي) لكونه درس الفيروس. بعد 30-60 دقيقة من العدوى ، ونضح قيحة ويغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني ، ثم تضاف متوسطة جديدة تستكمل مع المغير على تركيزات مناسبة. احتضان لفترة من الوقت المحدد في المادتين 1 و 2 الذي يطابق عيار الفيروس قصوى في هذه الظروف. حصاد الفيروس ذرية. عيار الفيروس في كل ممر وكرر الخطوات من 3 السابقة. خلال المقاطع القليلة الأولى ، وينبغي أن التتر الفيروس من العينات مطفر معاملة إسقاط تبعا لذلك ، مقارنة عيار الفيروس الأصلي والسيطرة (غير المعالجة وunpassaged) التتر الفيروس. إذا التتر فيروس مطفر passaged عينات الصعود مرة أخرى إلى نفس المستويات السيطرة غير المعالجة ، ويحتوي على عدد السكان المرجح متغير مطفر مقاومة. قد تكون مطلوبة تصل إلى 20 أو 30 الممرات ، على الرغم من أننا معزولة أكثر من المتغيرات إخلاصنا ما بين 5 و 15 الممرات. مرة واحدة التتر الفيروس لسلسلة مرور تصل إلى حجم معين نفس التتر السيطرة غير المعالجة ، واستخراج الحمض النووي الريبي من جميع العينات غير المعالجة بما في ذلك مراقبة مرور عدد من نفسه. ويمكن استخدام معدات استخراج الحمض النووي الريبي أو استخراج Trizol. أداء RT – PCR باستخدام بادئات أن تضخيم أو الجينات بوليميريز المتنسخة للفيروس من الفائدة. في الخطوة الثانية ، ينبغي أن تكون متسلسلة الجينوم كامل (على الأقل المناطق الترميز) لدراسة ما إذا كانت الظواهر المقاومة خريطة للجينات الفيروس الأخرى كذلك. وهذا أمر مهم خاصة بالنسبة للالمطفرة قاعدة تمثيلية ، مثل ريبافيرين ، مما يؤثر جوانب أخرى من الفيروسات وظيفة الخلية. في هذه الحالة قد تكون مقاومة لمتغير واحد من هذه الأنشطة المضادة للفيروسات وغيرها لن تكون البديل الإخلاص. تنقية المنتجات RT – PCR باستخدام طقم تنقية PCR وتسلسل للحصول على اجماع السكان مطفر المقاوم للتسلسل. وتشمل الضوابط الخلفية للخطأ التسلسل (انظر مناقشة). باستخدام البرمجيات والمحاذاة تسلسل تسلسل الفيروس الآراء كمرجع ، محاذاة متواليات. تحديد الطفرات نقطة جديدة ، مع إيلاء اهتمام خاص إلى أي التي تظهر على وجه الحصر في عدد السكان مطفر العلاج في الممر حيث التتر فيروس الوصول إلى مستويات طبيعية. إذا كان هذا التحول لم يكن موجودا في وقت سابق من الممرات وعدم وجود ضوابط غير المعالجة في عدد من ممر واحد (تشير إلى التكيف مع مرور ثقافة الخلية) ، ثم وهذا هو التحول المحتمل ان تكون مسؤولة ، جزئيا على الأقل ، من أجل مقاومة المغير. لا تعتمد على قاعدة ما يسمى تسلسل (إصدار نص تسلسل) والبرمجيات المحاذاة وحدها. للتحقق من قمم chromatograms الأقلية التي قد تكون قد ضاعت من قبل البرامج المحاذاة. وسوف يمثل متحولة 20-30 ٪ من مجموع السكان لا تزال تظهر بوصفها الذروة ، ولكنها صغيرة جدا بحيث لا يمكن تحديدها بوصفها 'N' بواسطة تحليل التسلسل القياسية. 4. مرة واحدة وقد تم التعرف على الطفرات وعزل أو إنشاء المتغير وتأكيد النمط الظاهري المقاومة لعدة المطفرة RNA المقبل ، يتم عزل تقديم البديل الطفرة التي تم تحديدها لتأكيد ربط عملتها النمط الظاهري المقاومة. فمن الضروري أن يتم دراسة الطفرات يشتبه في تغيير الدقة في خلفية نظيفة وراثيا (وهذا هو ، وليس تقديم الطفرات إضافية في مكان آخر في الجينوم). في الوضع الأفضل ، واستنساخ [كدنا] المعدية موجودة تسمح الجيل بمخزون من المتغير المغير المقاوم للموقع من قبل الطفرات الموجهة على خلفية الوراثية النقية. في هذه الحالة ، الباب 4 ليس ضروريا. ومع ذلك ، إذا كان استنساخ [كدنا] غير متوفر ، ويمكن أن يتم بمعزل عن تنقية لوحة من الفيروس ، هو موضح أدناه. قد تكون مطلوبة أكثر من جولة واحدة من تنقية البلاك لعزل متغير على خلفية نظيفة والجينية. عزلة طافرة مقاومة مطفر بواسطة فحص اللوحة. لعزل الطافرة التي تم تحديدها ، إجراء فحص لوحة موحدا تحت agarose (0.5 إلى 1 ٪ بالوزن النهائي / المجلد) تراكب في 6 لوحات جيدا. تحضير التخفيفات التسلسلي للفيروس ، استنادا إلى المخزون التتر ، لديلutions التي من شأنها انتاج ما بين لوحات كذلك فصل 10 و 50. عندما تكون مرئية بوضوح لويحات (عادة من 2 إلى 5 أيام إصابة آخر ، اعتمادا على الفيروس) ، وعلامة على موقع لويحات على لوحات واستخدام ماصة P200 مع تلميح مرشح ، يغرق بلطف غيض من خلال تراكب agarose والحرص على عدم طرد وتحول موقف تراكب (والذي من شأنه أن يؤدي إلى تلوث عبر لويحات الفردية). رفع بعناية غيض من التراكب ونقل المكونات agarose الواردة في تلميح إلى إيبندورف تحتوي على 250 ميكرولتر من المتوسط ​​والدوامة. لا تقلق إذا كان الطرف الذي لا يحتوي على إزالة agarose ، بحثا عن فيروسات الحمض النووي الريبي كثيرة ، درع متوسط ​​فيروسات RNA يحتوي على العديد من 10 5 الفيروسات وسيتم نقل كمية كافية ببساطة عن طريق لمس طرف على سطح اللوحة. التقاط ما يصل إلى 10 لويحات في العلاج المغير. اعتمادا على التسلسل chromatograms التي حددت الطفرة ، وتقدير ما يقرب من النسبة المئوية للسكان يحتوي على الطفرة المرجوة. الهدف هو عزل ثلاثة أو أربعة لويحات مع الطفرة. وبعض هذه المسوخ كما تحمل إضافية ، غير المرغوب فيها الطفرات ، والتي سوف تحددها في وقت لاحق التسلسل. استخراج الحمض النووي الريبي من هذه العينات (ولكن انقاذ نصف العينة لجعل أكبر مخزون من الفيروس) ، وتنفيذ RT – تقارير إتمام المشروعات التي من شأنها أن تسمح للتسلسل الجينوم بأكمله. في المتوسط ​​، وتحتوي على فيروسات الحمض النووي الريبي يصل الى اثنين من الاختلافات طفرية فيما يتعلق تسلسل توافق الآراء ، وبالتالي فإن تسلسل 3 أو 4 لوحة تنقية الفيروسات في وقت واحد لتحديد الذي يحتوي على عزل الطفرة المرجوة دون أي طفرات إضافية. حالما يتم التعرف ، وجعل أكبر مخزون من هذا الفيروس لجميع الدراسات النهائية ، وذلك باستخدام عينة لوحة المنقى الحصول أعلاه لتصيب أكبر قارورة من الخلايا ، مثل خلايا هيلا 8X10 6 في قارورة T75.. تأكيد حساسية مطفر / المقاومة التي يمنحها الطفرة التي تم تحديدها. استنساخ باستخدام معزولة أو المتولدة حديثا ، والسيطرة نوع الفيروس البري التي أعدت تحت ظروف مماثلة ، وتكرار التجارب في القسم 2 باستخدام مجموعة كاملة من تركيزات المغير ، أو التركيز الذي ولدت طفرة المقاومة. استخدام العديد من الظروف المختلفة RNA مطفرة (ريبافيرين ، فلورويوراسيل 5 ، 5 – آزاسيتيدين ، وزيادة 2 + المغنيسيوم ، المنغنيز 2 +). إذا كان البديل هو مقاومة بوليميريز إلى أكثر من نوع واحد من المغير ، فمن الأرجح أن هذا البديل هو الدقة العالية. بدلا من ذلك ، فمن الممكن أن طفرة المقاومة هي محددة لشرط واحد مطفرة ، وخصوصا ان بعض هذه المركبات تؤثر على فيروسات الحمض النووي الريبي من خلال عدد من الآليات 8. 5. تحقق معدلات تكرارها منذ الإخلاص – الطفرات تغيير في أغلب الأحيان إلى بوليميريز الخريطة ، فمن الممكن أن الطفرة بوليميريز نفسه سوف يغير كثيرا حركية النسخ وأنه من المهم لتحديد أوجه التشابه والاختلاف في النسخ المتماثل التي تسمح أفضل مقارنة الاختلافات في أداء الترددات طفرة أدناه. للقيام بذلك ، ودراسة التكرار من قبل ما لا يقل عن نهجين مجانية — واحدة أن يدرس إنتاج فيروس وآخر يفحص الحمض النووي الريبي التوليف. خطوة واحدة حركية نمو الفيروس في اليوم قبل التجربة ، والبذور 6 – جيدا لوحات حسب الحاجة ، واحد لوحة لكل نقطة من الوقت لفحصها. النظر في استخدام الآبار ثلاث نسخ لكل متحولة ونوع الفيروس البري. في يوم من التجربة ، وإزالة المتوسط ​​ويصيب الفيروس الآبار مع بعضها في وزارة الداخلية من 10 إلى ضمان أن يتم إصابة في وقت واحد في كل خلية. احتضان 30-60 دقيقة عند 37 درجة مئوية. لوحات صخرة كل 10 دقائق لتجنب جفاف المونولاير الخلية. إزالة الفيروسات ويغسل مرتين مع PBS 2 مل. ومن المهم لإزالة أكبر قدر من اللقاح ممكن. استبدال المتوسطة النمو. بعد الإصابة في الوقت = 0 ، الحصاد الفيروس من لوحة. عودة إلى حاضنة لوحات والحصاد للفيروسات على فترات منتظمة تمتد دورة النسخ المتماثل واحد (على سبيل المثال ل3H ، 5H ، 7H ، 9H ، 12H ، 24H). عيار الفيروس ، والتي تحصد في كل نقطة زمنية (مثل فحص اللوحة ، TCID50 ، FFU مقايسة) ، والرسم البياني للمنحنيات نمو عيار مقابل الوقت. حركية توليف الحمض النووي الريبي ويمكن رصد حركية توليف الحمض النووي الريبي باستخدام إحدى الطرق المبينة أدناه. إذا كان ذلك ممكنا ، ينبغي استخدام نفس العينات المستخدمة لتحديد حركية النمو من خطوة واحدة لقياس مستويات الحمض النووي الريبي. qRT – PCR. هذا الإجراء يعطي مقاييس كمية عالية من تكرارها على نطاق واسع ، من نسخ قليلة لجينوم> 10 10 ، تبعا لحساسية مقايسة. الاشعال تصميم والمجسات التي تغطي جزء صغير (<200 BP) من منطقة الجينومية الحفظ للغاية. </lط> شمال لطخة تحليل. وإن كانت أقل من الكمية qRT – PCR ، هذه التقنية البصرية التي تسمح تأكيد النتائج تكرارها في كامل طول الجينوم ، وأنه لا يحدث إنهاء سلسلة كبيرة نتيجة للطفرة بوليميريز. التعبير عن الجينات المراسل. إذا كان استنساخ [كدنا] التعبير عن الجين مراسل (على سبيل المثال luciferase) متوفرا ، ويجوز عندئذ يمكن استخدام هذا كبديل لفحص القدرات تنسخي. ومع ذلك ، لا ينبغي أن يستخدم الفيروس المؤتلف لتطبيقات أخرى (مثل تحديد وتيرة الطفرة) منذ ضغوط انتقائية بناء على هذا الفيروس لن يكون هو نفسه ، ولا سيما لأن هذه الفيروسات لديهم ميل إلى حذف الجينات مراسل المدرجة. 6. قياس الترددات الطفرة هذا هو خطوة حاسمة في تأكيد على أن الطفرة التي تمنح مقاومة بوليميريز المحددة لتكرار مطفر يغير الإخلاص. ومن المهم أن نلاحظ أن الطفرة قياس الترددات هنا ليست طفرة أسعار. لتحديد أسعار الفائدة ، لقياس دقيق للغاية من حركية النسخ المتماثل (كمية من الحمض النووي الريبي توليفها وطول دورة النسخ المتماثل) يجب أن يؤخذ فيها قياس الترددات الطفرة ومع ذلك ، طالما يتم رصد حركية التاريخ ومرور النسخ المتماثل ، ويوفر للتكرار ، والتدابير الكمية من النسخ المتماثل الإخلاص. ويمكن تحديد الترددات سواء في الطفرة السكانية الفيروس قابلة للحياة (استنساخ لوحة الحد أو التخفيف) أو في مجموع السكان الفيروس (الفيروس الأسهم أو طاف). لتحديد الترددات الطفرة ، وإعداد مخزونات فيروس من مرور وقت لاحق (على سبيل المثال مرور 2 أو بعده). من المهم أن السكان الفيروس كان لديها الوقت لتوسيع تنوعها الوراثي اقرب الى التوازن الطفرة الاختيار الأولي. ترددات تحور الفيروس قابلة للحياة السكان هذا النهج ، على الرغم من أن أكثر من شاقة ، ويعطي معلومات عن كيفية العديد من الطفرات موجودة على الجينوم المتوسط ​​الذي يحتفظ الاختصاص المتماثل. وتجدر الإشارة إلى أنه ، مع ذلك ، أن وجود تحيز للمتغيرات ستحدث أعلى للياقة البدنية ، وانخفاض اللياقة البدنية ، وقابلة للحياة المتغيرات التي لا البلاك بسهولة ، على سبيل المثال ، قد يتم الكشف عن ذلك. على هذا النحو ، فإنه يسمح أيضا أفضل تدابير مرادفة (DS) وغير مرادفة (DN) النوكليوتيدات التبديلات التي يمكن استخدامها لاستكشاف ما إذا كان اختيار ايجابية تعمل على السكان. ومع ذلك ، لأنه سيتم كميا أقل الطفرات ، وسوف تكون هناك حاجة لعدد أكبر من تسلسل للتحليل الإحصائي. هذه التقنية تعتمد على عزل الفيروسات الفردية عن طريق تنقية البلاك أو التخفيف مقيدا ، كما هو موضح أعلاه. كنقطة انطلاق ، نوصي عزل 48 "استنساخ" الفرد من نوع الفيروس البري والمتغير المغير المقاوم. يتوقع من كل السكان نسيلي المعزولة في هذه الطريقة للقيام بأي طفرة في الجينوم مؤسس المقدمة. كمية RNA موجودة في لوحة معزولة أو الحد من التخفيف على ما يرام عموما كافية لتضخيم بواسطة RT – PCR. إذا لزم الأمر ، يمكن استخدام التضخيم قصيرة (أقل من دورة واحدة تكرار) على الحد الأدنى لعدد الخلايا (على سبيل المثال 24 لوحة تنسيق جيد) للحصول على مزيد من الحمض النووي الريبي ، ولكن يجب أن يتم تنفيذ الحد الأدنى من التضخيم لتجنب تراكم طفرات جديدة. علما أن كل استنساخ والسكان إلى أن مقارنة يجب أن تخضع لنفس العدد من الدورات النسخ المتماثل. عزل الحيوانات المستنسخة الفيروس 24-48 بواسطة تنقية البلاك أو التخفيف الحد. استخراج الحمض النووي الريبي من سكان نسيلي معزولة RT – PCR تضخيم شظية تغطي ما يصل إلى 3KB عن كل عينة. فمن الأفضل لتغطية المنطقة البروتين الهيكلي ، الذي يميل إلى طفرات تحمل أكثر قدرة على البقاء من المناطق الأكثر حفظا من غير الهيكلية الجينات. تنقية PCR المنتجات ، وتسلسل وتحليل أداء الطفرة (القسم 7). ترددات تحور الفيروس مجموع السكان وعلى الرغم من أن الاستفادة من هذا الأسلوب الثاني هو أن يدرج المتغيرات حتى اللياقة البدنية المنخفضة في التسلسل ، والسماح صورة أوسع من الطيف من الطفرات. ومع ذلك ، فإنه قد لا يكون مثاليا لتحليل النشوء والتطور التي تفترض السكان الفيروس قابلة للحياة (على سبيل المثال DN / DS القيم) وتحديد الطفرات معظم ذات الصلة ، منذ قاتلة التغييرات (تغيير RNA الهيكل ، codons توقف ، حدوث تغيرات الأحماض الأمينية) لا يمكن تحديدها تماما وسيتم الاحتفاظ بها في التحليل. ومع ذلك ، فمن هذا الأسلوب يسمح للباحث الحصول على أهم البيانات الإحصائية لتأكيد التغيير الإخلاص عندما يكون هناك عدم وجود فحص في المختبر البيوكيميائية. هذا الأسلوب يعتمد على RT – PCR التضخيم من الحمض النووي الريبي مجموع الفيريون ، بما في ذلك العوامل الوراثية مع اللياقة البدنية المنخفضة أو الطفرات المميتة التي لن تنتج صفائح. لا يمكن للطفرة الترددات التي حصلت عليها هذه الطريقة تكون أعلى بمقدار 10 أضعاف من قبل لوحة تخفيف أو الحد من الاستنساخ. استخراج الحمض النووي الريبي من مجموع السكان الفيريون RT – PCR ampliFY منطقة 800-1200 النوكليوتيدات من جزء من تسلسل الجينوم الترميز ما هو معروف على تحمل طفرات ويكون التباين الوراثي (البروتينات الهيكلية مثلا). سيكون أكبر شظايا لا تضاف بسهولة إلى نواقل مثل الاستنساخ TopoTA وسوف تنتج أعدادا كافية من transformants. على الرغم من شظايا أصغر وحتى أفضل ، ويجوز للتغطية تسلسل الجينوم يكون قليلا جدا للحصول على دلالة إحصائية. قطعة من لا يقل عن 800 سنة مضت على تصاريح التغطية تسلسل مع اثنين من أجهزة الاشعال وتمثل حلا وسطا بين تعظيم تغطية جيدة وتقليل تكاليف تسلسل التسلسل. نجد أن ما بين 70 و 100 تسلسل تغطي المنطقة 800 النوكليوتيدات يؤكد بتكاثر والإخلاص غيرت من المتغيرات التي قمنا بدراستها في المختبر. علما أنه يمكن استخدام ناقلات أخرى / استنساخ أساليب ذات كفاءة متساوية. تنقية المنتج RT – PCR باستخدام طقم التجارية أو عن طريق استخراج الحمض النووي القياسية / هطول الأمطار. إذا كانت الإنزيمات RT – PCR استخدام لا تنتج ألف يتدلى ، نفذ ملحق الدقيقة 10 عن طريق إضافة ATP 1 ميكرومتر وبوليميريز طق TopoTA استنساخ باتباع إرشادات الشركة المصنعة عن أن تكون درست كل السكان الفيروس ، حدد 96 المستعمرات ، على النحو المحدد وجود إدراج الإيجابية التي زرقاء / بيضاء على لوحات فحص XGal المغلفة. في البداية ، واختبار وجود تدرج في كل منطقة يتم استنساخ الجينوم مختلفة ، للتأكد من صحة أزرق / أبيض الفرز بواسطة فحص حجم البلازميد على المواد الهلامية أو agarose PCR مستعمرة واحدة. باستخدام حجم القطعة والشروط المذكورة أعلاه ، أن نحقق نتائج إيجابية 90 ٪ تنمو في كل مستعمرة مرق السائل بين عشية وضحاها في 1 مل من المتوسط ​​LB في 96 لوحات ثقافة البكتيرية جيدا في اليوم التالي في شكل إعداد minipreps 96 – جيدا. تسلسل مع كل لوحة الاشعال بما فيه الكفاية (والشعائل المستخدمة لRT – PCR على سبيل المثال ، أو الشعائل TopoTA M13) للحصول على أقصى قدر من التغطية في الجزء مستنسخة. لتحليل الطفرة (القسم 7). 7. تحليل تسلسل إجراء تحاليل تسلسل باستخدام مرجع أو تسلسل الآراء لكل السكان والبرمجيات المناسبة المحاذاة. نوصي Lasergene Sequencher أو التي يمكن أن تحدد بسهولة النيوكلوتايد فيما يتعلق الآراء. محاذاة تسلسل باستخدام البرمجيات المناسبة (على سبيل المثال أو Lasergene Sequencher). تجاهل تسلسل نوعية رديئة (سيئة تدعو القاعدة ، الكثير من 'N أو قصيرة جدا في الطول). تحديد نطاق النوكليوتيدات التي تغطيها جميع متواليات. منذ مناطق مختلفة من الجينوم سوف تحمل أكثر أو أقل الطفرات ، لأسباب المقارنة فمن الضروري أن يتم تغطيتها بالكامل في المنطقة نفسها لكل استنساخ التسلسل المحتفظ بها لأغراض التحليل. وبالتالي ، إذا يتم تنفيذ العديد من ردود الفعل في تسلسل استنساخ ، وسلسلة واحدة للفشل استنساخ معين ، رفض استنساخ (جميع متواليات) من التحليل. تحديد وفرز النيوكلوتايد التي تختلف عن سلالة مرجعية. حساب وتيرة الطفرة بقسمة مجموع عدد النيوكلوتايد التي حددها عدد من النيوكليوتيدات التسلسل (عدد طول × استنساخ التسلسل المنطقة). كما يقدم هذا العدد متوسط ​​عدد من الطفرات في تسلسل NT 10K يجعل العدد أكثر سهولة ثم تركها وفقا النوكليوتيدات. على سبيل المثال ، بالنسبة للسكان النوع البري في الجدول رقم 1 ، 55 mutations/121 ، 978 النيوكليوتيدات مجموع 10000 = 4.51 X الطفرات في تسلسل النيوكليوتيدات 10000. إذا كان الحزب الوطني الاسكتلندي نفسه يظهر على عدد كبير من الحيوانات المستنسخة والحاضر والتي تشمل قيمتين أو استبعاد هذه الطفرات المتكررة. عموما ، بالنسبة لعدد السكان الفيروس المنتجة من أحد الوالدين متجانسة (عن طريق تنقية اللوحة أو من استنساخ معدية) وpassaged مرات قليلة فقط في خلية ثقافة ، واختيار الإيجابي لم تمارس تأثيراتها بما يكفي للتسبب في تراكم SNP نفسه وطفرة في تردد القيم تقاس بهذه الطريقة تعكس على نحو أفضل من تكرار الخطأ بوليميريز مع الحد الأدنى من الآثار الإيجابية للانتقاء أو تنقية. تحديد توزيع الطفرة. وضع قائمة مرتبة من عدد السكان في كل الحيوانات المستنسخة التي تقدم 0 ، 1 ، 2 ، 3 ، الخ… الطفرات في المنطقة متسلسلا. حساب الفيروسية تنوع السكان بالمقارنة المسافة البشرى. من تنظيفها ومتواليات تحريرها يدويا إعداد محاذاة المنطقة بما في ذلك المرجع. هناك برامج عدة محاذاة المتاحة : ClustalW / X ( http://www.clustal.org/ ) والعضلات ( http://www.drive5.com/muscle/ ) ، EbioX لمستخدمي ماك ( الموقع http://www.jawlan.org/golan/facts.htm. ebioinformatics.org / ebiox / ) ، الخ. تأكد من كل ما تبذلونه من متواليات وطول نفس ، والمحاصيل إذا لزم الأمر. فمن المستحسن أن تبدأ من متواليات هو ترميز كودون الخلفي لتسهيل التحليل. نقترح حفظ جميع التحالفات في شكل fasta ، وهو يقرأ بسهولة من قبل معظم البرامج المتاحة. <l ط> لإجراء تحليل المسافة البشرى ، وحساب جميع المقارنات الممكنة البشرى بين متواليات ينتمون إلى نفس السكان. ويمكن بعد ذلك الطفرات وجدت في المتوسط ​​مقارنة تحسب للإشارة إلى عدم التجانس السكاني. يمكن أن يكون مرادفا لقيم (DS) وغير مرادفة (DN) ضمن السكان الحصول عليها بسهولة. نجد البرنامج (MEGA http://www.megasoftware.net/) مفيدة وسهلة الاستخدام لهذا النوع من التحليل. للحصول على اتجاه اختيار نعطي احتمالين على الرغم من أنها ليست هي الوحيدة الممكنة. 1) الحصول على النسبة بين DN و DS. قيم أعلى من 1 يعني اختيار ايجابية. قيم أقل من 1 يعني اختيار تنقية. 2) استخدام مزود الويب Datamonkey ( http://www.datamonkey.org/ ). تحميل التحالفات الخاص بتنسيق fasta وتحليلها مع وحدة SLAC. هذا وسوف أعطيك تقدير DN / DS. إجراء التحليلات الإحصائية. اعتمادا على كمية البيانات وعدد من سلاسل ، ويمكن استخدام مجموعة متنوعة من الاختبارات. وقد اعتمدت بعض الدراسات على الاختبارات تشي مربع من إجمالي عدد الطفرات مقابل العدد الإجمالي من النيوكليوتيدات الآراء حيث يتم الجمع بين جميع الحيوانات المستنسخة 9. لقد أجريت دراسات أخرى الاختبارات فيشر الدقيق ، وتحسب على عدد من متواليات تقديم الطفرات في مقابل عدد من متواليات من دون طفرات 10. إذا تم إنشاؤها البيانات طفرية بما فيه الكفاية ، فإننا نوصي إجراء اختبار مبلغ المرتبة مثل مان ويتني U. للقيام بذلك ، رتبة عدد السكان في كل استنساخ الفيروس عن طريق عدد من الطفرات موجودة على كل تسلسل الحمض النووي الريبي. سيتم اختبار مان ويتني ثم الاختلافات في توزيع طفرة للسكان. لهذا السبب ، فإننا ننصح تسلسل أزواج القاعدة ما لا يقل عن 800 ، لزيادة احتمال العثور على استنساخ مع طفرات متعددة. هذا الاختبار هو قوي ، ولكن يتطلب أحجام أكبر من العينة. من ناحية أخرى ، فإنه لا يتطلب حجم العينة ذاتها ليجري مقارنة المجموعتين السكانيتين (على سبيل المثال ، عينات من الجدول رقم 1 ون 1 = 148 و ن 2 = 84). 8. ممثل النتائج : ويظهر تأثير الجرعة التي تعتمد على التركيز على بقاء الخلية المغير وقدرتها على البقاء الفيروس في الشكل 1. في هذا المثال ، وجدنا أن تم تخفيض مرور الفيروس في AZC ميكرومتر عيار 100 في الفيروس عن طريق السجل 10،5-2 المستهدفة ، ولكن بقاء الخلية هيلا لا أثر سلبيا خلال الأيام 2 اللازمة لعدوى الفيروس. هذه التجربة الرائدة أدت إلى اختيار تركيز 100 ميكرومتر AZC للمرور التسلسلي للفيروس ، لتحديد المغير للمقاومة. ويوضح الشكل 2 التخفيض الأولي في عيار ، يليها ظهور النمط الظاهري المقاومة المغير. خلال المقاطع القليلة الأولى في المغير ، والطفرات المميتة تتراكم وانخفاض كبير في التتر الفيروس يحدث. تدريجيا ، ومتغير مطفر المقاوم يظهر لها بنشوء يتزامن مع العودة إلى التتر الفيروس لا تختلف عن الضوابط غير المعالجة. في هذه المرحلة ، وهي نسبة كبيرة من السكان ويعرض الفيروس تحور المقاومة. تسلسل هذه الفئة من السكان فيروس يكشف عن تغيير حمض أميني (ق) المسؤولة. حالما يتم التعرف ، ومعزولة أو المتولدة حديثا ، قد الفيروس المقاوم مطفر تكون أقل حساسية من نوع البرية المطفرة RNA مختلفة (النظير قاعدة بنية مختلفة ، على سبيل المثال). الشكل 3 يبين مطفر RNA مقاومة فيروس كوكساكي B3 أن التتر أعلى من نوع البرية في حضور ريبافيرين ، 5 فلورويوراسيل ، و 5 آزاسيتيدين ، وMgCl عالية (2) وMnCl 2. مقاومة واسعة النطاق لالمطفرة RNA هو مؤشر قوي على الإخلاص تكرارها المتزايد. التحقق من أن حركية تكرار المتغير الإخلاص مشابه لفيروس نوع البرية ستساعد في المقارنة بين الترددات الطفرة. الشكل 4 يصور خطوة واحدة للنمو حركية متغير الدقة العالية بالمقارنة مع نوع البرية. إذا كانت معدلات تكرارها والتتر النهائي ليست مماثلة ، ثم يجب اتخاذ خطوات لفيروس السكان مقارنة مشابهة من حيث الحجم ، التي خضعت لنفس العدد من جولات من التكرار. لا ارتباط بين سعر توليف الحمض النووي الريبي والإخلاص تتميز النسخ المتماثل بشكل جيد ، لا سيما في الجسم الحي. قد أبطأ معدل تكرار نتيجة الطفرة في وتيرة انخفاض (أعلى الإخلاص) ، رغم أن هذا ليس قاعدة مطلقة ، كما هو مبين في الشكل 4. مع المعلمات أعلاه المنشأة ، يمكن مقارنة الترددات تحور المتغير الإخلاص والسكان نوع البرية الوراثية للحصول على تأكيد من الدقة تكرار تغييرها. الشكل 5 يبين تسلسل المحاذاة من نوع البرية وعالية الدقة البديل ، مع تحديد الطفرات نقطة. المرتبة يتم الاعتماد على الطفرات ، وفقا لعدد من الطفرات في استنساخ (الجدول 1) ، وممثلا وتيرة الطفرة متوسط ​​عدد السكان ، في تسلسل النيوكليوتيدات 10000 ، الشكل (6). <p clasق = "jove_content"> الشكل 1. تحديد الظروف المثلى لتحديد الحمض النووي الريبي للمقاومة مطفر : عولجوا جدوى الإبقاء على خلية عالية مع خلايا هيلا المعتدل (1-2 سجل انخفاض في عيار فيروس) مع تركيز وأشار ريبافيرين من المصابين البرية B3 نوع الفيروس كوكساكي في وزارة الداخلية. من 0.01. إصابة آخر 48 ساعة ، وكان حصاد ذرية الفيروس والتي تم تحديد التتر TCID 50. يشار إلى أن نسبة الخلايا على قيد الحياة العلاج في 48 ساعة ، والتي تحددها تلطيخ التريبان الأزرق ، تحت محور س. وأظهرت النتائج أن تركيزات 100 و 200 ميكرومتر التتر الفيروس عن طريق خفض سجل 1-2 ، دون أن يؤثر بقاء الخلية. الشكل 2. مرور التسلسلي في وجود تركيزات معتدلة من الحمض النووي الريبي المطفرة يختار للسكان المغير مقاومة ، وفي هذا الشكل ، كان passaged شيكونغونيا الفيروس في خلايا هيلا في حضور ريبافيرين ميكرومتر 50 (القضبان الرمادية). تم تنفيذ الممرات في غياب الرقابة ريبافيرين (القضبان السوداء). بعد كل مرور ، وكان كميا سلالة الفيروس عن طريق فحص اللوحة الكلاسيكية على خلايا BHK. تأثير واضح مطفرة خلال الممرات الأول (P1 و P2 مقارنة مع عدد السكان بدءا P0) حيث يعامل انخفاض بنسبة 2 التتر الفيروس السجل. تدريجيا ، والعودة إلى مستويات التتر (غير المعالجة) العادي. ويلاحظ وجود فروق كبيرة بين السكان مرور 5 مطفر العلاج مقارنة مع غير المعالجة ، مما يشير إلى أنه تم تحديد المتغيرات مقاومة. في الواقع ، تحديد تسلسل الآراء من السكان الطفرات فريدة من نوعها في السكان الفيروس يمر ريبافيرين العلاج. الشكل 3. تأكيدا للمقاومة واسعة النطاق لبنية الحمض النووي الريبي المطفرة مختلفة. وكان ظاهر هنا ، ولدت عالية من الدقة البديل A372V فيروس كوكساكي B3 التي كانت معزولة في البداية في الشاشة وصفها في القسم 3 من استنساخ المعدية واختبارها لحساسيتها بالنسبة لتركيزات مختلفة من المطفرة مختلفة RNA (ريبافيرين ، فلورويوراسيل 5 – 5 – آزاسيتيدين). تم علاج خلايا هيلا مع تركيزات ريبافيرين وأشار من المصابين البرية B3 نوع الفيروس كوكساكي في وزارة الداخلية من 0.01. إصابة آخر 48 ساعة ، وكان حصاد ذرية الفيروس والتي تم تحديد التتر TCID 50. تظهر هنا هي من النوع البري التتر (خطوط الصلبة) وA372V البديل (الخطوط المتقطعة) كدالة للتركيز المغير. A372V التتر على الدوام أعلى من النوع البري في ظل جميع الظروف التي تم اختبارها. الشكل 4. معدلات تكرار والمتغيرات الإخلاص. لتحديد حركية النمو من خطوة واحدة للإنتاج الفيروس ، وأصيب 10 في خلايا هيلا = وزارة الداخلية مع أي نوع البرية (خط الصلب) ، وارتفاع الإخلاص البديل A372V (شرطات طويلة) أو متغير تكرار نقص Cx64 (قصيرة شرطات) من فيروس كوكساكي B3. وأشار في الوقت نقطة ، وكان حصادها من سلالة الفيروس الخلايا والتي supernatants للتجمد والذوبان titered بواسطة TCID 50. زيادة الدقة من A372V لا يتزامن مع خلل المتماثل يمكن ملاحظتها في زراعة الأنسجة. ويقدم البديل Cx64 تأخير كبير في حركية النسخ ويصل الحد الأقصى الذي يتم التتر 1000 – أضعاف أقل من نوع الفيروس البري. الشكل 5. محاذاة متواليات TopoTA المستنسخة من كل السكان الفيروس. استخدام النهج المبينة في المادة 7 ، كل تسلسل تم الحصول عليها من المنتجات RT – PCR المستنسخة تنبع من المفترض أن الجينوم ، واحدة فريدة من نوعها ضمن مجموع السكان الفيروس وبالتالي فإنها ، تحمل طفرات فريدة من نوعها. هذا الرقم يدل على محاذاة نموذجية ، وبعد تنظيف متواليات نوعية رديئة وتصور تعدد الأشكال. يتم الاعتماد على النيوكلوتايد مجموع (10 في هذا الشكل) ضمن مجموعة من السكان ، وأشار عدد من تعدد الأشكال التي تظهر على كل استنساخ. على سبيل المثال ، عن طريق استنساخ أكد بار ، ويحتوي على 2 في حين أن الطفرات فريدة 8 استنساخ أخرى تحتوي على واحد ، طفرة فريدة من نوعها. وتستخدم هذه البيانات لتجميع الجدول 1. لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم ، يرجى الضغط هنا . الشكل 6. التمثيل البياني للترددات تحور الفيروس السكان. الأسهل للحصول على تفسير ، ويمكن تمثيل البيانات الرقمية التي تم الحصول عليها من تسلسل والتحليلات الإحصائية على النحو المخطط إما ، أو الرسم البياني (كما هو موضح هنا). A372V فيروس يولد أقل من الطفرات نوع البرية ويمثل طفرة تردد أقل من ذلك بكثير (* ، P <0.01). المتغير Cx64 ، أن يعيد إلى التتر 1000 – أضعاف أقل من النوع البري ، بريهالوالدان وتيرة الطفرة نفسها (NS ، وليس كبيرا) تشير إلى أن سرعة النسخ ليست مرتبطة بالضرورة والإخلاص. نفس شيكونغونيا الفيروس (الاعراض بأنها ناتجة) السكان يعطي ترددات طفرة مماثلة ما إذا كان الفيروس الأسهم ، أو التخفيف 10 5 أضعاف ، وتستخدم لاستخراج الحمض النووي الريبي. طفرة توزيع ملخص للتحليل الإحصائي. ملاحظة : للحصول على كل استنساخ ، فمن الضروري أن يتم تغطية منطقة الجينوم نفسه (وطول تسلسل). في هذه الحالة ، 859 النيوكليوتيدات في استنساخ. هذا أمر بالغ الأهمية للتحليلات الإحصائية. من ناحية أخرى ، واختبارات تستخدم لرتبة مجموع التحليل الإحصائي لا تتطلب أن يكون حجم العينة نفسها ، وباحث حر في السكان مقارنة لاختلاف حجم العينة. وبالتالي ، يمكن مقارنة استنساخ 142 من النوع البري لاستنساخ 84 من A372V. استنساخ # مع الطفرات ن نوع البرية A372V 7 الطفرات 0 0 6 الطفرات 0 0 5 الطفرات 0 0 4 طفرات 0 0 3 الطفرات 1 0 2 الطفرات 6 2 1 الطفرات 40 14 0 الطفرات 95 68 مجموع الطفرات 55 18 استنساخ مجموع متسلسلة 142 84 النيوكليوتيدات مجموع متسلسلة 121978 72156 Mutations/10 NT 4 4.51 2.49 الجدول 1. . طفرة ملخص التحليل الإحصائي لتوزيع ملاحظة : للحصول على كل استنساخ ، فمن الضروري أن تتناول نفس المنطقة الجينومية (وطول تسلسل). في هذه الحالة ، 859 النيوكليوتيدات في استنساخ. هذا أمر بالغ الأهمية للتحليلات الإحصائية. من ناحية أخرى ، واختبارات تستخدم لرتبة مجموع التحليل الإحصائي لا تتطلب أن يكون حجم العينة نفسها ، وباحث حر في السكان مقارنة لاختلاف حجم العينة. وبالتالي ، يمكن مقارنة استنساخ 142 من النوع البري لاستنساخ 84 من A372V.