Multi-fotone Imaging di invasione delle cellule tumorali in un modello di mouse ortotopico di carcinoma orale a cellule squamose
Summary
Una panoramica completa delle tecniche coinvolte nella generazione di un modello murino di cancro orale e monitoraggio quantitativo di invasione tumorale all'interno della lingua attraverso multi-fotone microscopia di cellule marcate è presentato. Questo sistema può essere utilizzato come piattaforma utile per la valutazione molecolare e di efficacia dei farmaci anti-invasiva composti.
Abstract
Loco-regionale invasione della testa e del collo è legato al rischio di metastasi e presenta una sfida difficile nella progettazione e attuazione delle strategie di gestione del paziente. Ortotopico modelli murini di cancro orale sono state sviluppate per facilitare lo studio dei fattori di impatto che l'invasione e fungere da sistema modello per la valutazione delle terapie anti-tumorali. In questi sistemi, la visualizzazione di cellule tumorali disseminate all'interno dei tessuti del cavo orale è stato generalmente effettuato da istologia convenzionale o con metodi in vivo bioluminescenti. Un inconveniente principale di queste tecniche è l'incapacità intrinseca di visualizzare e quantificare con precisione presto l'invasione delle cellule tumorali che derivano dal sito primario in tre dimensioni. Qui si descrive un protocollo che combina un modello stabilito per il carcinoma a cellule squamose della lingua (SCOT) con immagini a due fotoni per consentire la visualizzazione multi-vettoriale di diffusione del tumore linguale. La OSC-19 testa e collo, tumori linea cellulare è stata stabilmente progettato per esprimere la F-actina LifeAct legame peptidico fuso con la proteina fluorescente mCherry (LifeAct-mCherry). Fox1 nu / nu topi iniettati con queste cellule affidabile formare tumori che permettono la lingua per essere visualizzate da ex-vivo applicazione della microscopia a due fotoni. Questa tecnica permette di visualizzare ortotopico della massa tumorale e localmente invadere le cellule in lingue asportato senza interruzioni del microambiente tumorale regionale. Inoltre, questo sistema consente la quantificazione di invasione delle cellule tumorali dal calcolo delle distanze che muovono le cellule invase dal sito primario del tumore. Nel complesso questa procedura prevede un sistema potenziato modello per l'analisi dei fattori che contribuiscono all'invasione SCOT e trattamenti terapeutici su misura per prevenire l'invasione locale ea distanza diffusione metastatica. Questo metodo ha anche il potenziale per essere in ultima analisi, in combinazione con altre modalità di imaging in un ambiente nel vivo.
Protocol
Discussion
Modelli murini ortotopico si sono dimostrati utili per studiare molti aspetti della testa e del collo 1,2. Abbiamo combinato un sistema ben stabilito ortotopico di SCOT 3 con immagini di microscopia a due fotoni di cellule mCherry-etichettato come un sistema per studiare gli eventi iniziali della testa e del collo, l'invasione delle cellule tumorali. In questa procedura, abbiamo notato che le cellule possono fuoriuscire dal sito di iniezione del tumore, specialmente nei topi sei settimane o più giovani a causa delle dimensioni della lingua insufficiente. Noi usiamo topi più anziani per evitare questo problema. La dimensione lingua più grandi con i topi aiuta anche a evitare la rottura di una arteria linguale e le emorragie eccessive dalla lingua. Prendere tumore è notevolmente migliorata quando la lingua si gonfia notevolmente nel sito di iniezione iniziale. Questo attenua il gonfiore entro 1-2 ore, come il liquido iniettato viene assorbita. La crescita del tumore appare evidente 1-2 settimane dopo l'iniezione con il numero indicato di cellule iniettate come un piccolo urto bianco sulla superficie della lingua. Notiamo anche che l'obiettivo a 40X utilizzati nei nostri studi qui presentati, non possiamo distinguere le cellule tumorali individuale, ma si identificano IG come gruppi di cellule invasive che ricapitolano la modalità tipica di invasione HNSCC.
Ad oggi questo modello è stato ampiamente utilizzato per testare il ruolo di molecole specifiche così come molti farmaci antitumorali sulla crescita SCOT un'invasione, con efficacia misurato con metastasi linfonodali cervicali determinati con IHC o bioluminescenti 4-7. Tumori formati in questo manifesto sistema vicino alla superficie della lingua (Figura 7), che consente l'applicazione della microscopia a due fotoni ai tumori intera immagine in situ, come invasiva multicellulari cluster. La procedura può anche essere utilizzato per visualizzare l'invasione tumorale con risoluzione cellulare. Microscopia a due fotoni è stato precedentemente utilizzato per studiare trattamenti sperimentali per la testa e del collo in 8,9 ortotopica e xenotrapianto 8,10 modelli. Tuttavia, ci sono due differenze sostanziali tra queste relazioni e il nostro protocollo. In primo luogo, questi studi utilizzare le etichette extracellulare per target / identificare le cellule tumorali della testa e del collo, possibilmente limitando il rilevamento solo alle cellule tumorali con ampio accesso alla circolazione. In secondo luogo, l'invasione delle cellule tumorali nei pressi del sito principale che racchiude in sintesi l'attività probabilmente all'inizio del metastatico non è stato valutato come un parametro sperimentale. Il nostro protocollo prevede la possibilità di quantificare direttamente l'invasione delle cellule tumorali in qualsiasi momento durante la progressione del tumore in lingue mouse. Mentre il metodo descritto qui descrive la procedura con lingue sezionato, siamo attualmente in fase di adattare questo metodo per invasione immagine del tumore nei topi dal vivo per l'uso in combinazione con bioluminescenza di monitorare contemporaneamente l'invasione iniziale, locali di coinvolgimento dei linfonodi e metastasi a distanza nel stesso animale. Modifiche al protocollo di imaging in vivo richiede la progettazione di un adeguato livello per il posizionamento e il mantenimento di topi durante l'imaging, così come un pratico sistema per irrigare adeguatamente la cavità orale di topi anestetizzati durante la procedura di imaging. Una volta ottimizzato, questi adattamenti offrirà la possibilità di studiare il ruolo di potenziali molecole pro-invasiva e invasiva di composti anti-test su invasione locale e più distante coinvolgimento metastatico in animali per periodi di tempo prolungati.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Supportato da un sottoprogetto di NIH concedere P20 RR16440 e una borsa di studio ponte presso l'Ufficio West Virginia University di ricerca e gli studi universitari al S. Weed. Assistenza tecnica da L. Lopez-Skinner durante le prime fasi di sviluppo del progetto si ringrazia. Gli autori sono grati per l'assistenza tecnica e OSC19 cellule di J. Myers e M. Younes (Dipartimento di Chirurgia Testa e Collo, MD Anderson Cancer Center, Houston, TX), P. Turner e K. Secrest (West Virginia University Department of Patologia Banca dei Tessuti) per l'elaborazione istologica e delle procedure, R. Wysolmerski (West Virginia University, Dipartimento di Anatomia e Neurobiologia) per il LifeAct-mCherry costruire e J. Bear (University of North Carolina) per il vettore pLL7.0 lentivirale. L'utilizzo del Fondo per la Virginia Occidentale Imaging Microscopy University (sostenuto da NIH concedere P20 RR16440 e Maria Babb Randolph Cancer Center) e la sua non-lineare laboratorio di microscopia ottica (NLOM, supportato da una collaborazione tra la West Virginia University Center for Neuroscience e la West Virginia University Dipartimento di Fisica / West Virginia nanoscienza Initiative) è anche riconosciuto con gratitudine. Il NLOM è supportato in parte dal NIH concedere P30 RR031155 al Centro di Neuroscienze.
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