Multi-Photonen-Imaging der Tumorzellinvasion in einem orthotopen Mausmodell des oralen Plattenepithelkarzinoms
Summary
Einen umfassenden Überblick über die Techniken bei der Erzeugung von einem Maus-Modell von Mundkrebs und quantitative Überwachung der Tumorinvasion in die Zunge durch Multi-Photonen-Mikroskopie markierter Zellen beteiligt wird vorgestellt. Dieses System kann als eine nützliche Plattform für die molekulare Beurteilung und Wirksamkeit von Medikamenten von anti-invasive Verbindungen dienen.
Abstract
Loco-regionale Invasion von Kopf-Hals-Krebs ist es, metastasiertem Risiko verbunden und stellt eine schwierige Herausforderung in der Gestaltung und Umsetzung Patienten-Management-Strategien. Orthotopen Mausmodell von Mundkrebs wurden entwickelt, um die Untersuchung der Faktoren, die Erleichterung der Auswirkungen Invasion und dienen als Modellsystem für die Beurteilung Anti-Tumor-Therapeutika. In diesen Systemen wurde die Visualisierung von disseminierten Tumorzellen im Mundraum Gewebe in der Regel entweder durch konventionelle Histologie oder mit in vivo Biolumineszenz Methoden durchgeführt worden. Ein Hauptnachteil dieser Techniken ist die inhärente Unfähigkeit, genau zu visualisieren und zu quantifizieren frühen Tumorzellinvasion aus dem primären Standort in drei Dimensionen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das ein etabliertes Modell für Plattenepithelkarzinom der Zunge (SCOT) mit Zwei-Photonen-Imaging zu Multi-Vektor-Visualisierung von mehrsprachigen Tumorausbreitung ermöglichen verbindet. Die OSC-19 Kopf-Hals-Tumor-Zelllinie wurde stabil entwickelt, um die F-Aktin-bindende Peptid LifeAct fusioniert mit dem mCherry fluoreszierende Protein (LifeAct-mCherry) auszudrücken. Fox1 nu / nu-Mäuse mit diesen Zellen injiziert zuverlässig Tumoren bilden, dass die Zunge sichtbar gemacht werden durch ex-vivo Anwendung der Zwei-Photonen-Mikroskopie ermöglichen. Diese Technik ermöglicht die Visualisierung orthotopen der Tumormasse und lokal eindringenden Zellen in ausgeschnittenen Zungen ohne Unterbrechung der regionalen Tumor-Mikroumgebung. Darüber hinaus ermöglicht dieses System für die Quantifizierung von Tumorzellinvasion durch Berechnung Entfernungen, die Zellen bewegen sich vom Primärtumor Ort eingedrungen. Insgesamt ist dieses Verfahren bietet eine erweiterte Modellsystem zur Analyse der Faktoren, die zu SCOT Invasion und therapeutische Behandlungen zugeschnitten auf lokaler Invasion und fernen Metastasierung zu verhindern beitragen. Auch diese Methode hat das Potenzial, um letztendlich mit anderen bildgebenden Verfahren in einem In-vivo-Einstellung kombiniert werden.
Protocol
Discussion
Orthotopen Mausmodell haben sich für das Studium viele Aspekte der Kopf-und Halstumoren 1,2 nützlich. Wir haben ein gut etabliertes System der orthotopen SCOT 3 mit Zwei-Photonen-Mikroskopie von mCherry-markierten Zellen als System bis in die frühen Ereignisse des Kopfes und Halses Tumorzellinvasion Studie zusammengefasst. In diesem Verfahren haben wir festgestellt, dass Zellen können von der Website des Tumorinjektion Leck, vor allem bei Mäusen sechs Wochen oder jünger aufgrund unzureichender Zunge Größe. Wir verwenden älteren Mäusen, um dieses Problem zu vermeiden. Je größer der Zunge Größe mit älteren Mäusen hilft auch bei der Vermeidung von Bruch einer Arteria lingualis und übermäßige Blutungen aus der Zunge. Tumor zu nehmen, wird entscheidend gestärkt, wenn die Zunge schwillt dramatisch an der Stelle der ersten Injektion. Diese Schwellung innerhalb von 1-2 Stunden, da die injizierte Flüssigkeit aufgesogen ist. Das Tumorwachstum scheint evident 1-2 Wochen nach der Injektion mit dem angegebenen injiziert Zellzahl wie eine kleine weiße Beule auf der Zungenoberfläche. Wir stellen ferner fest, dass bei der 40X-Objektiv in unserem hier vorgestellten Studien verwendet werden, können wir nicht unterscheiden, einzelne Tumorzellen aber IGs als invasive Zellhaufen, dass die typische Form der HNSCC Invasion rekapitulieren zu identifizieren.
Bis heute hat dieses Modell wurde ausgiebig zum Testen der Rolle von spezifischen Molekülen sowie mehrere Anti-Tumor-Medikamente auf SCOT Wachstum einer Invasion, mit der Wirksamkeit von zervikalen Lymphknotenmetastasen überwacht mittels IHC-oder Biolumineszenz-Verfahren 4-7 gemessen werden. Tumoren in diesem System manifestieren in der Nähe der Zungenoberfläche (Abbildung 7) gebildet, so dass die Anwendung der Zwei-Photonen-Mikroskopie Bild gesamten Tumoren in situ als invasive mehrzelligen Cluster. Das Verfahren kann auch genutzt werden, um Tumorinvasion mit zellulärer Auflösung sichtbar zu machen. Zwei-Photonen-Mikroskopie wurde bereits genutzt, um experimentelle Behandlungen für Kopf-und Hals-Krebs in orthotopen 8,9 und 8,10 Xenograft-Modellen zu studieren. Es gibt jedoch zwei wesentliche Unterschiede zwischen diesen Berichten und unser Protokoll. Erstens verwenden diese Studien extrazellulären Etiketten zum Ziel / identify Kopf und Hals Tumorzellen, möglicherweise begrenzen Erkennung nur auf Tumorzellen mit reichlich Zugang zu den Umlauf. Zweitens Invasion von Tumorzellen in der Nähe der primären Standort, die wahrscheinlich rekapituliert frühen metastatischen Aktivität nicht als eine experimentelle Parameter beurteilt. Unser Protokoll bietet die Möglichkeit, direkt zu quantifizieren Tumorzellinvasion zu irgendeinem Zeitpunkt während der Tumorprogression in Maus Zungen. Während die hier beschriebene Methode beschreibt das Verfahren, mit seziert Zungen sind wir derzeit in den Prozess der Anpassung dieser Methode an image Tumorinvasion in lebenden Mäusen für den Einsatz in Kombination mit Biolumineszenz gleichzeitig überwachen frühen Invasion lokalen Lymphknotenbefall und Fernmetastasen in der dasselbe Tier. Änderungen des Protokolls für in-vivo-Bildgebung erfordern eine angemessene Bühne für die Positionierung der Gestaltung und Pflege von Mäusen während der Bildgebung, sowie ein praktisches System, um richtig zu bewässern die Mundhöhle von narkotisierten Mäusen während der bildgebenden Verfahren. Einmal optimiert, so werden diese Anpassungen bieten die Möglichkeit, die Rolle des potenziellen Pro-invasive Moleküle und die Prüfung anti-invasive Verbindungen auf lokaler Invasion und Fernmetastasen Beteiligung an Tieren über einen längeren Zeitraum zu untersuchen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Unterstützt durch ein Teilprojekt des NIH P20 RR16440 und eine Brücke Zuschuss von der West Virginia University Office of Research und Graduate Education auf S. Weed. Technische Unterstützung von L. Lopez-Skinner in den frühen Phasen der Projektentwicklung wird dankbar anerkannt. Die Autoren sind auch dankbar für technische Hilfe und OSC19 Zellen von J. Myers und M. Younes (Department of Head and Neck Surgery, MD Anderson Cancer Center, Houston, TX), P. Turner und K. Secrest (West Virginia University Department of Pathology Tissue Bank) für die histologische Verarbeitung und Verfahren, R. Wysolmerski (West Virginia University, Department für Neurobiologie und Anatomie) für die LifeAct-mCherry konstruieren und J. Bär (University of North Carolina) für die pLL7.0 lentiviralen Vektor. Die Nutzung der West Virginia University Microscopy Imaging Facility (unterstützt durch NIH P20 RR16440 und Mary Babb Randolph Cancer Center) und seine nicht-lineare optische Mikroskopie-Labor (NLOM, unterstützt durch eine Zusammenarbeit zwischen der West Virginia University Center for Neuroscience und der West Virginia University Department of Physics / West Virginia Nanoscience Initiative) ist ebenfalls herzlich gedankt. Die NLOM wird zum Teil durch NIH P30 RR031155 dem Center for Neuroscience unterstützt.
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