Multi-photon imagerie de l'invasion des cellules tumorales dans un modèle de souris orthotopique du carcinome épidermoïde oral
Summary
Un aperçu complet des techniques impliquées dans la génération d'un modèle murin de cancer de la bouche et le suivi quantitatif de l'invasion tumorale au sein de la langue grâce à la microscopie multi-photons de cellules marquées est présenté. Ce système peut servir de plate-forme utile pour l'évaluation de l'efficacité des médicaments moléculaires et des composés anti-invasive.
Abstract
Loco-régionale invasion de la tête et du cou est liée à un risque métastatique et présente un défi difficile à relever dans la conception et la mise en œuvre des stratégies de gestion des patients. Des modèles de souris orthotopique de cancer par voie orale ont été développés pour faciliter l'étude des facteurs que l'invasion de l'impact et de servir comme système modèle pour évaluer la thérapeutique anti-tumorale. Dans ces systèmes, la visualisation des cellules tumorales disséminées dans les tissus cavité buccale a généralement été menée soit par histologie conventionnelle ou avec des méthodes bioluminescentes vivo. Un inconvénient majeur de ces techniques est l'incapacité inhérente à visualiser et de quantifier précisément au début d'invasion des cellules tumorales provenant du site primaire en trois dimensions. Nous décrivons ici un protocole qui associe un modèle établi pour carcinome épidermoïde de la langue (SCOT) avec l'imagerie à deux photons pour permettre multi-vectorielle de visualisation de la propagation des tumeurs linguales. La CVMO-19 la tête et du cou lignée cellulaire tumorale a été stable pour exprimer l'LifeAct F-actine de liaison peptidique fusionnée à la protéine fluorescente mCherry (LifeAct-mCherry). Fox1 souris nu / nu injecté ces cellules de manière fiable former des tumeurs qui permettent la langue pour être visualisé par l'ex-vivo application de microscopie à deux photons. Cette technique permet la visualisation orthotopique de la masse tumorale et localement envahir les cellules en langues excisée sans perturbation du microenvironnement tumoral régional. En outre, ce système permet la quantification de l'invasion des cellules tumorales par le calcul de distances qui ont envahi déplacer des cellules à partir du site primaire tumeur. Globalement, cette procédure prévoit un système modèle amélioré d'analyse des facteurs qui contribuent à l'invasion SCOT et des traitements thérapeutiques adaptés pour prévenir l'invasion locale et distante dissémination métastatique. Cette méthode a également le potentiel pour être couplée éventuellement à d'autres modalités d'imagerie dans un dans la mise en vivo.
Protocol
Discussion
Des modèles de souris orthotopique sont révélés utiles pour étudier de nombreux aspects de la tête et du cou 1,2. Nous avons combiné un système bien établi orthotopique du SCOT 3 avec imagerie par microscopie à deux photons de cellules mCherry-étiqueté comme un système pour étudier les événements précoces de la tête et l'invasion des cellules tumorales du cou. Dans cette procédure, nous avons noté que les cellules peuvent s'échapper du site de l'injection de tumeurs, en particulier dans des souris de six semaines ou plus jeune en raison de la taille insuffisante la langue. Nous utilisons des souris plus âgées afin d'éviter ce problème. La grande taille de la langue avec les souris plus âgées contribue également à éviter la rupture d'une artère linguale et l'hémorragie excessive de la langue. Prendre la tumeur est grandement améliorée quand la langue enfle considérablement sur le site de l'injection initiale. Ce gonflement disparaît dans les une à deux heures que le fluide injecté est absorbé. La croissance tumorale semble évident de une à deux semaines après l'injection avec le nombre de cellules injectées indiqué comme une petite bosse blanche sur la surface de la langue. Nous notons également que l'objectif 40X utilisés dans nos études présentées ici, nous ne pouvons pas distinguer les cellules tumorales individuelles mais ne identifier les GIs que des amas de cellules envahissantes qui récapitulent le mode typique de l'invasion CETC.
À ce jour, ce modèle a été largement utilisée pour tester le rôle de molécules spécifiques, ainsi que plusieurs médicaments anti-tumoraux sur la croissance SCOT une invasion, avec une efficacité mesurée par métastases ganglionnaires cervicales surveillée en utilisant des méthodes IHC ou bioluminescentes 4-7. Tumeurs formées dans ce système de se manifester à proximité de la surface de la langue (Figure 7), permettant l'application de la microscopie à deux photons pour les tumeurs in situ image entière comme envahissantes multi-cellulaires grappes. La procédure peut également être utilisé pour visualiser l'invasion tumorale avec une résolution cellulaire. Microscopie à deux photons a déjà été utilisé pour étudier les traitements expérimentaux pour cancer tête et cou dans 8,9 orthotopique et xénogreffe 8,10 modèles. Cependant, il ya deux différences majeures entre ces rapports et notre protocole. Premièrement, ces études utilisent des étiquettes extracellulaire de cibler / identifier la tête et du cou cellules tumorales, éventuellement en limitant uniquement à la détection des cellules tumorales avec un large accès à la circulation. Deuxièmement, l'invasion des cellules tumorales à proximité du site principal qui récapitule l'activité susceptible début métastatique n'a pas été évalué comme un paramètre expérimental. Notre protocole permet de quantifier directement l'invasion des cellules tumorales à tout moment pendant la progression tumorale dans les langues de la souris. Alors que la méthode décrite ici décrit la procédure à l'aide langues disséqués, nous sommes actuellement en train d'adapter cette méthode à l'invasion tumorale chez la souris l'image en direct pour une utilisation en combinaison avec la bioluminescence de surveiller simultanément l'invasion précoce locale des ganglions lymphatiques et métastases à distance dans le même animal. Modifications du protocole pour l'imagerie in vivo nécessitent la conception d'un stade approprié pour le positionnement et le maintien des souris lors de l'imagerie, ainsi que d'un système pratique pour bien irriguer la cavité buccale des souris anesthésiées pendant la procédure d'imagerie. Une fois optimisé, ces adaptations offrira la possibilité d'étudier le rôle du potentiel pro-invasif molécules et les tests anti-invasive composés sur l'invasion locale et plus éloignés des métastases chez des animaux sur de longues périodes.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Soutenu par un sous-projet du NIH P20 RR16440 et une subvention du pont de l'Office West Virginia University de la recherche et aux études supérieures aux mauvaises herbes S.. L'assistance technique de L. Lopez-Skinner pendant les premières phases de développement du projet est grandement appréciée. Les auteurs sont également reconnaissants pour l'assistance technique et OSC19 cellules de J. Myers et M. Younes (département de chirurgie de la tête et du cou, du MD Anderson Cancer Center, Houston, TX); P. Turner et K. Secrest (West Virginia University Département de Banque de tissus de pathologie) pour le traitement histologique et des procédures, R. Wysolmerski (West Virginia University, département de neurobiologie et d'anatomie) pour la construction LifeAct-mCherry et J. Bear (Université de Caroline du Nord) pour le vecteur lentiviral pLL7.0. L'utilisation de la facilité de la West Virginia University Imaging Microscopy (soutenu par NIH et le P20 RR16440 Mary Babb Randolph Cancer Center) et ses non-linéaire laboratoire de microscopie optique (NLOM; soutenu par une collaboration entre le Centre West Virginia University for Neuroscience et l'Université West Virginia Department of Physics / West Virginia Nanoscience Initiative) est également appréciée. Le NLOM est soutenu en partie par NIH P30 RR031155 le Center for Neuroscience.
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