Multi-foton Imaging van de tumorcel invasie in een orthotope Muis Model van Oral plaveiselcelcarcinoom
Summary
Een uitgebreid overzicht van de technieken die betrokken zijn bij het genereren van een muismodel van orale kanker en kwantitatieve controle van de tumor invasie in de tong door middel van multi-foton microscopie van gelabelde cellen wordt gepresenteerd. Dit systeem kan dienen als een nuttig platform voor de moleculaire beoordeling en werkzaamheid van het geneesmiddel van anti-invasieve verbindingen.
Abstract
Loco-regionale invasie van hoofd-en halskanker is gekoppeld aan uitgezaaide risico en presenteert een moeilijke uitdaging in het ontwerpen en implementeren van behandeling van de patiënt strategieën. Orthotope muismodellen van orale kanker zijn ontwikkeld om de studie van de factoren die invloed te vergemakkelijken invasie en als modelsysteem voor het evalueren van anti-tumor geneesmiddelen dienen. In deze systemen, is de visualisatie van uitgezaaide tumorcellen in mondholte weefsels meestal uitgevoerd door een conventionele histologie, of met in vivo bioluminescente methoden. Een van de belangrijkste nadeel van deze technieken is de inherente onvermogen om nauwkeurig te visualiseren en te kwantificeren vroege tumorcel invasie die voortvloeien uit de primaire locatie in drie dimensies. Hier beschrijven we een protocol dat een uitgewerkt model voor het plaveiselcelcarcinoom van de tong (SCOT) met twee-foton beeldvorming om multi-lingual vectorial visualisatie van tumor zich laten combineert. Het OSC-19 hoofd en de nek tumor cellijn werd stabiel ontworpen om de F-actine bindende peptide LifeAct gefuseerd met het mCherry fluorescerend eiwit (LifeAct-mCherry) te drukken. Fox1 nu / nu muizen geïnjecteerd met deze cellen vormen een betrouwbare tumoren die het mogelijk maken de tong te worden gevisualiseerd door ex-vivo toepassing van twee-foton microscopie. Deze techniek maakt het mogelijk om orthotope visualisatie van de tumormassa en lokaal binnendringende cellen in tongen weggesneden zonder onderbreking van de regionale tumor micro-omgeving. Daarnaast, dit systeem zorgt voor de kwantificering van de tumorcel invasie door het berekenen van afstanden die cellen verplaatsen binnengevallen van de primaire tumor site. Algemene deze procedure voorziet een verbeterde model systeem voor het analyseren van factoren die bijdragen aan SCOT invasie en therapeutische behandelingen afgestemd op de lokale invasie en verre metastatische verspreiding te voorkomen. Deze methode heeft ook de potentie om uiteindelijk te combineren met andere beeldvormende modaliteiten in een in vivo setting.
Protocol
Discussion
Orthotope muismodellen nuttig zijn gebleken voor het bestuderen van vele aspecten van hoofd-en halskanker 1,2. We hebben samen een gevestigde orthotope systeem van SCOT 3 met twee-foton microscopie beeldvorming van mCherry-gemerkte cellen als een systeem om het begin van de gebeurtenissen van hoofd en nek tumorcel invasie te bestuderen. In deze procedure hebben we geconstateerd dat cellen kan lekken van de plaats van de tumor injectie, vooral bij muizen zes weken of jonger wegens onvoldoende tong grootte. We maken gebruik van oudere muizen om dit probleem te voorkomen. De grotere tong grootte met oudere muizen helpt ook bij het vermijden van breuk van een linguale slagader en overmatige bloedingen uit de tong. Tumor te nemen is sterk verbeterd wanneer de tong zwelt dramatisch op de plaats van eerste injectie. Deze zwelling verdwijnt binnen een uur of twee als de ingespoten vloeistof is geabsorbeerd. Groei van de tumor lijkt evident een tot twee weken na de injectie met het aangegeven geïnjecteerde cel nummer als een kleine witte bult op de tong oppervlak. We stellen ook vast dat bij de 40X objectief gebruikt in onze studies hier gepresenteerd, kunnen we niet individuele tumorcellen te onderscheiden maar GR identificeren als invasieve cel clusters die de typische wijze van SCCHH invasie samenvatten.
Tot op heden dit model wordt veelvuldig gebruikt voor het testen van de rol van specifieke moleculen evenals verscheidene anti-tumor drugs op SCOT groei van een invasie, met de werkzaamheid gemeten door cervicale lymfe gecontroleerd knooppunt metastasering met behulp van IHC-of bioluminescente methoden 4-7. Tumoren gevormd in dit systeem manifest dicht bij de tong oppervlak (Figuur 7), die de toepassing van twee-foton microscopie op het beeld gehele tumoren in situ als invasief multi-cellulaire clusters. De procedure kan ook worden gebruikt om tumor invasie te visualiseren met cellulaire resolutie. Twee-foton microscopie is eerder gebruikt om experimentele behandelingen voor hoofd-hals kanker in orthotope 8,9 en 8,10 xenograft modellen te bestuderen. Er zijn echter twee belangrijke verschillen tussen deze rapporten en onze protocol. De eerste, deze studies maken gebruik van extracellulaire labels te richten / hoofd en de nek tumor cellen te identificeren, mogelijk beperken detectie alleen tumorcellen met ruime toegang tot de circulatie. Ten tweede invasie van tumorcellen dicht bij de primaire plaats die waarschijnlijk recapituleert vroeg uitgezaaide activiteit niet was beoordeeld als een experimentele parameter. Ons protocol biedt de mogelijkheid om tumorcel invasie rechtstreeks te kwantificeren op enig moment tijdens de progressie van de tumor in de muis tongen. Terwijl de hier beschreven methode beschrijft de procedure met behulp van ontleed tongen, we zijn op dit moment in het proces van aanpassing van deze methode om de afbeelding tumor invasie in levende muizen voor gebruik in combinatie met bioluminescentie gelijktijdig te volgen begin van de invasie, de lokale betrokkenheid van de lymfeklieren en metastasen op afstand in de hetzelfde dier. Wijzigingen in het protocol voor in vivo beeldvorming vereisen het ontwerpen van een passend tijdstip voor het plaatsen en onderhouden van muizen tijdens beeldvorming, evenals een praktisch systeem om de mondholte van verdoofde muizen goed spoelen tijdens de beeldvorming procedure. Eenmaal geoptimaliseerd, zullen deze aanpassingen bieden de mogelijkheid om de rol van de potentiële pro-invasieve moleculen en het testen van anti-invasieve verbindingen op de lokale invasie en nog veel meer op afstand uitgezaaide betrokkenheid bij dieren gedurende langere perioden te bestuderen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ondersteund door een deelproject van het NIH subsidie P20 RR16440 en een brug subsidie van de West Virginia University Office of Research en Graduate Onderwijs om S. Weed. Technische bijstand van L. Lopez-Skinner tijdens de vroege fasen van projectontwikkeling is dankbaar erkend. De auteurs zijn ook dankbaar voor technische bijstand en OSC19 cellen van J. en M. Myers Younes (Department of Head and Neck Surgery, MD Anderson Cancer Center, Houston, TX), P. Turner en K. Secrest (Universiteit van West Virginia Department of pathologie Tissue Bank) voor de histologische verwerking en procedures, R. Wysolmerski (West Virginia University, Department of Neurobiologie en Anatomie) voor de LifeAct-mCherry construeren en J. Beer (Universiteit van North Carolina) voor de pLL7.0 lentivirale vector. Het gebruik van de West Virginia University Microscopie Imaging Facility (ondersteund door NIH subsidie P20 RR16440 en de Maria Babb Randolph Cancer Center) en de niet-lineaire optische microscopie laboratorium (NLOM, ondersteund door een gezamenlijke samenwerking tussen de West Virginia University Center for Neuroscience en de Universiteit van West Virginia Department of Physics / West Virginia Nanoscience Initiative) is ook dankbaar erkend. De NLOM wordt gedeeltelijk ondersteund door de NIH subsidie P30 RR031155 aan het Center for Neuroscience.
References
- Sano, D., Myers, J. N. Xenograft models of head and neck cancers. Head Neck Oncol. 1, 32-32 (2009).
- Kim, S. Animal models of cancer in the head and neck region. Clin Exp Otorhinolaryngol. 2, 55-60 (2009).
- Myers, J. N., Holsinger, F. C., Jasser, S. A., Bekele, B. N., Fidler, I. J. An orthotopic nude mouse model of oral tongue squamous cell carcinoma. Clin Cancer Res. 8, 293-298 (2002).
- Sano, D., Myers, J. N. Metastasis of squamous cell carcinoma of the oral tongue. Cancer Metastasis Rev. 26, 645-662 (2007).
- Sano, D. The effect of combination anti-endothelial growth factor receptor and anti-vascular endothelial growth factor receptor 2 targeted therapy on lymph node metastasis: a study in an orthotopic nude mouse model of squamous cell carcinoma of the oral tongue. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 135, 411-420 (2009).
- Kupferman, M. E. TrkB induces EMT and has a key role in invasion of head and neck squamous cell carcinoma. Oncogene. 29, 2047-2059 (2010).
- Ammer, A. G. Saracatinib Impairs Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Invasion by Disrupting Invadopodia Function. J Cancer Sci Ther. 1, 52-61 (2009).
- Rosenthal, E. L., Kulbersh, B. D., King, T., Chaudhuri, T. R., Zinn, K. R. Use of fluorescent labeled anti-epidermal growth factor receptor antibody to image head and neck squamous cell carcinoma xenografts. Mol Cancer Ther. 6, 1230-1238 (2007).
- Gleysteen, J. P. Fluorescent labeled anti-EGFR antibody for identification of regional and distant metastasis in a preclinical xenograft model. Head Neck. 30, 782-789 (2008).
- Bhirde, A. A. Targeted killing of cancer cells in vivo and in vitro with EGF-directed carbon nanotube-based drug delivery. ACS Nano. 3, 307-316 (2009).
