Üç Boyutlu İnsan Cilt Model Yeniden İnşa: Aracı Normal Cilt ve Melanom İlerleme Eğitim

1. Üç Boyutlu İnsan Cilt Modeli Yeniden İnşa: Acellular tabakasının Hazırlanışı: 0.59 ml 10X EMEM, 50 ul 200mm L-glutamin, 0.6 ml FBS, 120 ul% 7.5 Sodyum bikarbonat ve 4.6 mL sığır kollajen I. 1 ml: 50 ml tüp içinde buz üzerinde aşağıdaki reaktifler karıştırın doku kültürü tepsileri her ekleme içine karışımı. Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe ve jel katılaşmaya izin. Saman-sarı karışımı rengi pembe olmalıdır. DMEM nötralize etmek için% 10 FBS içeren eklemek için,% 0.25 'lik tripsin / EDTA ile kültür şişeler insan fibroblastlar Trypsinize. % 10 FBS ile 1,5 mL DMEM santrifüj ve tekrar süspansiyon 0.45 x 10 6 hücre hücre toplayın. Dermal kök hücreler için küreler, santrifüj ayırmak için balon dokunarak 6600 dermal küreler (dermal kök hücreler kök hücre ortamda büyür, onlar neurospheres benzer bir şekilde küre formunda) toplamak. Hücre tabakasının Hazırlanışı: 50 ml tüp içinde buz üzerinde aşağıdaki karıştırın: 1.65 ml 10X EMEM, 150 ul 200 mM L-glutamin, 1.85 ml FBS, 350 ul% 7.5 Sodyum bikarbonat, 14 mL sığır kollajen I ve 1.5 mL fibroblastlar süspansiyon Adım 2 (alternatif olarak, 1.5 mL cildin dermal kök hücre yeniden yapılandırır için orta yeniden 0.45 x 10 6 fibroblastlar ve 6600 dermal küreler kombinasyonunu kullanabilirsiniz), iyice karıştırın. Her acellular tabaka kaplı eklemek için 3 ml karışımı ekleyin. , 37 ° C'de% 5 CO 2 doku kültürü inkübatör 45 dakika inkübe edin . Karışımın rengi pembe sarı saman olmalıdır. Sonra jel katılaşır, DMEM% 10 FBS (içinde 2 ml ve 10 ml dışında cilt yeniden tepsileri her bir kuyunun eklemek) içeren ekleyin. 4 gün boyunca inkübe ve jel sözleşmeleri emin olun. Içinde ve dışında her ekleme orta aspire. Düzenli serum yıkayın için eklemek dışında iç ve 10 ml (% 1 diyaliz FBS ile HBSS) 2 ml orta yıkama ekleyin. 37 1 saat inkübe ° C Cildin hazırlanması yeniden orta: Normal melanosit ve dermal kök hücre için yeniden yapılandırır: temel, orta (500 ml) yapmak için, aşağıdaki reaktifler karışımı: 490 ml serum serbest keratinosit orta, 1.8 ml sığır hipofiz ekstresi, 10 ml diyaliz fetal sığır serumu, 10 mikrogram / 500 ul ml SCF, 562,5 4 mcg / mL bFGF ve 264 mikrogram / mL ET-3, 500 ul ul. Orta I: 10 ul 100 mg / ml 100 ml temel orta EGF ekleyin. Orta II: 2 ul EGF 100 ml temel orta ekleyin. Orta III: 720 ul CaCl 2 1 M 300 ml temel orta ekleyin. Melanom cilt için yeniden: Orta I (100 ml), aşağıdaki reaktifler karışımı yapmak: DMEM, 72.5 ml, F12 24 ml (HAM Kullanıcı), 2 mL 200 mM L-glutamin, 269 g / ml, 200 200 ul hidrokortizon 500X ul ITES 0.05 200 ul O-phosphorylethanolamine M, 90 mM 200 ul adenin, 2 nM 200 ul Progesteron, 1 240 ul CaCl 2 M 10 nM 200 ul Siteye girmekle bu şartları ve chelexed yeni doğan buzağı serum 100 ul (100 ml serum Chelex 100 3 g çözülür 1.5 saat karıştırın 4 ° C, sterilize). Orta II (100 ml) yapmak için, aşağıdaki reaktifler karışımı: DMEM, 72.5 ml, F12 24 ml (HAM Kullanıcı), 2 mL 200 mM L-glutamin, 269 g / ml, 500X, 200 ul ITES 200 ul hidrokortizon, 200 ul 0.05 'O-phosphorylethanolamine M, 200 mM 90 ul adenin, 2 nM 200 ul Progesteron, 1 M 240 ul CaCl2, 10 nM ve 100 ul yeni doğmuş buzağı serumu 200 ul Siteye girmekle bu şartları. Orta III (300ml) yapmak için, aşağıdaki reaktifler karışımı: DMEM, 142,5 ml, F12 142,5 ml (HAM Kullanıcı), 200 mM L-glutamin 6 ml, 269 g / ml, 500X, 600 ul ITES 600 ul hidrokortizon 0.05, 600 ul O-phosphorylethanolamine M, 600 mM 90 ul adenin, 2 nM 600 ul Progesteron, 1 720 ul CaCl 2 M, 10 nM ve 6 ml yeni doğmuş buzağı serumu 600 ul Siteye girmekle bu şartları. 0.05% tripsin / EDTA ile kültür şişeler insan keratinositler Trypsinize soya fasulyesi tripsin inhibitörü (250 mg / L 1x fosfat tamponlu salin) ile nötralize tripsin, aşağı dönmeye yeniden orta deride 4,17 x10 6 hücre / ml hücre pelletini tekrar süspansiyon I. Cilt x10 6 hücre / mL orta I. yeniden aşağı döndürmek 0.83 hücre pelletini tekrar süspansiyon, soya fasulyesi tripsin inhibitörü nötralize tripsin ile,% 0.05 tripsin / EDTA ile insan melanosit veya melanom hücrelerinin kültür şişeler Trypsinize Her ekleme hem de iç ve dış yıkama, orta çıkarın. Cildin orta (iç ve dışında her ekleme 10 ml 1.5 ml) yeniden ekleyin. Keratinosit ve melanosit veya melanom hücrelerinin 600 ul hücre süspansiyonu 600 ul hücre süspansiyonu atın iyice karıştırın. Her ucun içine damla 200 ul karışık hücre süspansiyonu damla koyun. Dermal kök hücre yeniden, sadece keratinosit süspansiyon 100 ul kullanın. 37 az 2 gün boyunca inkübe ° C. Aspire cilt orta yenideniçinde ve her ucun dışında. Cilt orta II (içerden ve dışarıdan 10 ml 2 ml) yeniden ekleyin. 37 başka bir 2 gün boyunca inkübe ° C. Aspire cilt içine orta II yeniden ve her ucun dışında, 7.5 ml deri sadece dışarıdan orta III yeniden ekleyin. Bu noktadan itibaren, yüzey havaya maruz kalma başlar yeniden yapılandırır. Orta III 18 gün kadar her gün değiştirin. Hasat gün 18 cilt yeniden: Medya içinde ve dışında ekler aspire. Forseps ile ekler tepsiden çıkarın. Neşter bir bıçak ile bir daire kenarına yakın izleme (polikarbonat filtre dahil) yeniden Kes. Yarısında sert bir yüzey üzerinde yeniden ve filtre kesin. Parafin bölümler için: 2 siyah TBS biyopsi makaleleri arasında bir histoloji kaset yeniden ve en fazla 4 saat süreyle% 10 formalin içinde tüm kaset emmek bir buçuk yerleştirin. Ardından% 70 etanol içinde kaset yeri ve 4 saklayın ° C parafine gömme için yeniden işlemek için hazır olana kadar. Frozen için: Diğer yarısını yerleştirin 4% 50 sakaroz yeniden ° C, 1-2 saat, daha sonra 2M sakaroz değiştirmek ve başka bir 1-2 saat 4 ° C sıcaklıkta saklayın. Teknenin yaklaşık% 50 doldurur, böylece tek bir baz kalıp içine optimum kesim sıcaklık donma medya (OCT) koyun. OCT kabarcıkları kaçının. Forseps ile yeniden kenarına alın ve sakaroz yeniden kaldırmak. Kimwipes sakaroz absorbe kadar Kimwipes yerleştirin. Forseps ve spatula kullanarak, OCT üstüne baz kalıp içine yeniden aktarın. Baz kalıp tamamen dolu olduğu kadar daha fazla OCT ile yeniden üst kapağı. Zor kesim yapacak OCT kabarcıkları zorunda değilsiniz emin olun. Baz kalıp ezilmiş kuru buz üzerinde eşit olarak yerleştirin ve OCT tamamen dondurmak için izin. Kalay folyo ile sarın ve temel kalıp -70 saklayın ° C ile bir Kriyostat kesmek için hazır olana kadar. Greft bir deri bir fare üzerinde yeniden: 5 ml DMEM (dondurma ve buz çözme fare cilt için) 50 ml şahin tüp hazırlayın. 6 hafta etrafında bir kadın SCID tüysüz outbred fare kullanın. Fare izofluran (EZ anestezi sistemi) ile anestezi: İlk anestezi 4 izofluran (% fare cerrahi yatağa taşındı önce) ve korumak anestezi ile işlem sırasında bir roket ucu konisi havalandırma yoluyla indüksiyon odasında yapılır (izofluran% 1.5-2 .) Hipotermi ve anestezi sırasında göz yaralanmasını önlemek için uygulanan steril oftalmik yağ önlemek için ısıtılmış bir yastık ısı desteği. Bir beher içinde 600 ml su koyun ve 40 arasında su sıcaklığı tutmak için sıcak bir plaka üstüne bırakın – 60 ° C. Bileşik benzoin tentürü ve alkol hazırlık bezlerden fare cilt temizleyin. Fare sırt üstünde bir çizgi, daha sonra dikilmesi için aynı pozisyonda tutmak için işaretleyin. Iris makas ve forseps kullanarak fare sırtın üst kısmında 1.2 cm çapında yuvarlak bir yara kesin. , Steril gazlı bez sünger ile yara yatak örtüsü. Tamamen donmuş kadar DMEM 5 ml yuvarlak fare cilt koyun, sonra sıvı azot kabı bırakmak. Defrost sıcak bir plaka üstüne sıcak su tüp tamamen çözülmüş kadar. 3 kez tekrarlayın. Cilt cerrahi bıçak kullanarak transwell yeniden ve çok dikkatli bir şekilde membran kaldırmak Ayır, deride yara üstüne yeniden aktarmak (kadar epidermis tarafında). Cilt yeniden üstüne farenin deri (epidermis kadar tarafı) yerleştirin. Önceden etiketli marker ilk dikiş, fare derisi düzeltmek için iki tarafta sütürler daha sonra, alt tarafındaki ikinci olun. Aşılama sonrası Temizlik fare cilt. Roket ucu konisi çıkarın ve uyanık ve ayaktan kadar ısıtılmış pad üzerinde fare tutmak. Yeni bir kafesin içine fare koyun. Ameliyattan hemen sonra deri altı enjeksiyon, ameliyat sonrası 24 saat ve 48 saat Meloksikam (1 mg / kg): operatif analjezi gönderin. 2. Temsilcisi Sonuçlar: Cilt Normal melanositler ve dermal kök hücreleri ile yeniden yapılandırır Cilt, ekleriyle birlikte özel bir 6 kuyu tepsi kültüre yeniden yapılandırır. Dermal bölmesi (Şekil 1A), ilk dört gün için% 10 FBS ile DMEM kültür. Cilt yeniden orta keratinositler melanosit veya melanom hücrelerinin (Şekil 1B) numaralı seribaşı zaman kullanılır. Epidermis 9 gün havaya maruz kalan ve bu keratinositler (Şekil 1C) ayırt etmek için izin verir. 18 gün, cildin epidermis tabakalı keratinosit katmanlardan oluşmaktadır yeniden yapılandırır. Farklılaşmamış sırayla farklılaşmış bazal tabaka ve katmanları dikey odaklı (Şekil 1D). Lekemelanositik işaretleyici S100 ile yeniden yapılandırır bölümünde ing bu melanositlerin bazal tabakası olan epidermis ve iletişim dendrit uzantıları (Şekil 1E) yoluyla birden fazla keratinositler hizalanır gösterir. Dermal bölmesi bir kollajen tip I matriks içinde gömülü fibroblastlar içerir. Tevdi kollajen IV epidermis, dermis (Şekil 1F) ayıran bazal membran gösterir. Dermal kök hücreler (GFP lentiviral vektör ile etiketlenen) fibroblastlar kollajen ben matris gömülü ettiklerinde, epidermisin göç ve melanosit (1), (Şekil 2) farklılaşırlar. Epidermisin keratinositlerin çoklu katmanlar geliştirilmiştir. Cilt melanom tümörleri, yeniden yapılandırır Klinikopatolojik çalışmalar göstermektedir ki melanomlar kademeli bir şekilde ilerleme: sık görülen edinsel nevus, displastik nevüs, ALP (radyal büyüme fazı) melanomlar, VGP melanomlar (dikey büyüme fazı) ve metastatik melanomlar (7). Melanom hücre hatları farklı aşamalarında 2-GE kültürü (Şekil 3A-D) birbirlerine morfolojik olarak benzer ancak cildi yeniden yapılandırır dahil olduğunda, hücrelerin davranışını in vivo özellikleri yansıtır . Konumu ve normal melanosit büyüme hızı, sıkı deri (Şekil 3E) yeniden yapılandırır kontrol edilir. VGP melanomlar WM793 dermis (Şekil 3G) invaziv büyümeye ise ALP primer melanomlar WM35, epidermis (Şekil 3F) ağırlıklı olarak çoğalırlar. Metastatik melanomlar 1205Lu agresif derin dermis (Şekil 3H) işgal etti. Şekil 1. Cilt Normal melanositler ile yeniden yapılandırır. Cildin brüt görünümü AC gösterilir yeniden yapılandırır. A. Fibroblastlar kollajen ile karışık% 10 içeren DMEM FBS ve form dermal bölmesi yetiştirilmektedir. B. Keratinositler ve melanosit dermisin üst numaralı seribaşı ve yeniden orta deride gelişir. C. Epidermis 9 gün havaya maruz kalmaktadır. D. H & E-lekeli cilt yeniden dikey olarak oluşan Epidermis, bazal tabaka odaklı, ve sırayla farklılaşmış tabakalı hücre tabakaları sunar. Dermis kollajen tip I matris gömülü fibroblastlar içerir. E. S100-pozitif melanosit (siyah ok), bazal membran ve iletişim birden fazla keratinositler ile hizalanır. F. Kollajen IV-boyama, epidermis, dermis ayıran bazal membran, gösterir. DF tüm renklendirmeler formalin ile fikse, parafine gömülü bölümler yapıldı. Şekil 2. Ciltte dermal kök hücreleri, epidermisin göç ve melanosit içine ayırt yeniden yapılandırır. Tohumlama keratinositler At 5 gün sonra, tek GFP pozitif hücreler (yeşil) kürelerden göç başlar . Epidermis, hala tek bir katman oluşur. 8 gün, birkaç hücre epidermis-dermis arabirimi ulaşır. 10. günde, GFP pozitif hücreler bazal membran pozisyonda sıkıca hizalanır. Göç, GFP pozitif hücreler epidermisin ifade melanositik işaretleyici HMB45 (kırmızı, beyaz oklarla gösterildiği gibi). Çekirdekler DAPI (mavi) ile boyandı. Epidermis çoklu katmanlar olarak geliştirilmiştir. Bazal membran beyaz noktalı çizgiler ile gösterilir. Şekil 3. Cilt melanomlar farklı aşamalarında yeniden yapılandırır: AD. Normal melanositler ve melanom hücrelerinin 2D kültürlerde büyüdü. A. sünnet derisi Melanositler. B. ALP WM35 hücreleri. C. VGP WM793 hücreleri. D. metastatik melanom 1205Lu hücreleri. E. Normal melanositler bazal membran bulunmaktadır. F. ALP melanom WM35 hücreler epidermiste hücre kümeleri olarak büyür. G. VGP melanom WM793 hücreler bazal membran ile dermis içine işgal etti. H. metastatik melanom 1205Lu hücreleri agresif dermis derinliklerine işgal etti. Sorun Giderme Sorun Sorun Giderme Kollajen karışım katılaşmaya değildir Kollajen karışımı rengi pembe saman sarı olmalıdır, aksi takdirde pH yanlış ve kollajen jel olmayabilir. Sarı rengi parlak, daha fazla sodyum bikarbonat damla damla ilave edilmelidir. Kollajen erken mixuture içinde çökeltileri Tüm bileşenleri kollajen karışımı yerleştirin üzerine yerleştirilir kadar buz tutunuz Sözleşmeli kolajen (bir tarafı diğer tarafı daha kalın) bile değildir Kalibre raf kuluçka Epidermis en az üç keratinosit katmanları ile oluşur. Alt geçişleri farklılaşmamış keratinositler kullanın