三次元ヒト皮膚は、モデルを再構築：ノーマルスキンとメラノーマ進行を勉強するツールを

1。三次元ヒト皮膚は、モデルを再構築： 無細胞層の調製：0.59 mLの10X EMEM、50μlの200mmのL -グルタミン、0.6 mLのFBS、120μlの7.5％の重炭酸ナトリウムおよび4.6 mLのウシコラーゲンIの1 mLを追加：氷上で50 mLのチューブに以下の試薬を混合組織培養トレーの各インサートに混合。室温で30分間インキュベートし、ゲルが固化することができます。混合物の色は淡黄色からピンクにしてください。 DMEMを中和するために10％FBSを含む追加、0.25％トリプシン/ EDTAで培養フラスコからヒト線維芽細胞をトリプシン処理。 10％FBSを1.5 mLのDMEMで遠心分離し、再懸0.45 × 10 6個の細胞で細胞を回収。皮膚幹細胞の場合は、遠心分離、球を分離するためにフラスコをタップすることで、6600皮膚の球を（皮膚の幹細胞は幹細胞の培地で生育したとき、彼らはニューロスフェアと同様の方法で球を形成する）を収集。 細胞層の調製：氷の上を50mLチューブに次のようにミックス：1.65 mLの10X EMEM、150μlの200mMのL -グルタミン、1.85 mLのFBS、350μlの7.5％の重炭酸ナトリウム、14mlのウシコラーゲンIおよび1.5 mLの線維芽細胞の懸濁液ステップ2（代 ​​わりに、皮膚幹細胞再構築のために私培地を再構成皮膚の1.5mLの、0.45 × 10 6線維芽細胞および6600真皮球の組み合わせを使用する）から、よく混ぜる。それぞれの無細胞層でコーティングされたインサートの混合液を3 mLを加え。 37℃で5％CO 2組織培養インキュベーターで45分間インキュベートする。混合物の色はピンクに黄色の麦わらからする必要があります。ゲルが固化した後、DMEM 10％FBSを（2mLの内側と皮膚の再構築トレイの各ウェルに挿入10mLの外）を含む追加。 4日間インキュベートし、ゲルの契約のことを確認してください。 各インサートの内側と外側の両方から培地を吸引除去する。定期的に血清を洗い落とすために、内側とインサートの外側に10mLに培地（1％透析FBSとHBSS）を2mLの洗浄に追加します。 37℃で1時間インキュベート℃に皮膚の準備は、メディアを再構築： 正常メラノサイトと皮膚幹細胞のために再構築：基本培地（500 mL）を作成するには、以下の試薬を混合：490 mLのケラチノサイト無血清培地、1.8 mLのウシ下垂体抽出物、10 mLの透析ウシ胎児血清、10μgの/ 500μLをmLのSCF、4μg/ mLのbFGFおよび264μg/ mLのET – 3の500μlの562.5μL。培地I：100mLの基本培地に100μg/ mlの10μlのEGFを追加する。培地II：100mLの基本培地に2μlのEGFを追加する。培地III：300mlの基本培地に1 Mの720μlのCaCl 2を追加。 黒色腫の皮膚のために再構築：中I（100mLの）は、以下の試薬を混ぜるようにするには：DMEMの72.5 mLの、F12の24 mLの（HAMのを）、2 mLの200 mMのL -グルタミン、269 g / mlで、200の200μlのヒドロコルチゾン500XμlのITES、200μlの0.05のO – phosphorylethanolamine M、90 mMの、2 nmの200μlのプロゲステロン、1 M 240μLのCaCl 2、10 nMの200μlのトリヨードチロニンとchelexed新生児ウシ血清100μlを200μlのアデニン（、血清100mLにChelex 100の3gを溶解し4℃で1.5時間℃で、フィルター滅菌をかき混ぜる）。ミディアムII（100mLの）を作るために、以下の試薬を混ぜる：DMEMの72.5 mLの、F12の24 mLの（HAMのを）、2 mLの200 mMのL -グルタミン、269 g / mlで、500Xの200μlのITES200μlのヒドロコルチゾン、 1 M、10 nMの200μlのトリヨードチロニンと100μlの新生児ウシ血清の200μlの0.05のO – phosphorylethanolamine M、90 mMの200μlのアデニン、2 nmの200μlのプロゲステロン、240μlの塩化カルシウム。ミディアムIII（300ML）を作るために、以下の試薬を混合：DMEMの142.5 mLの、F12の142.5 mLの（HAMの）、200mMのL -グルタミンの6 mLを、269 g / mlで、500Xの600μlのITESの600μlのヒドロコルチゾン、0.05の600μlのO – phosphorylethanolamine M、90 mMの600μlのアデニン、2 nmの600μlのプロゲステロン、1の720μLのCaCl 2、M、10nmと6 mLの新生児ウシ血清の600μlのトリヨードチロニン。 大豆トリプシンインヒビター（1Xリン酸塩の250 mg / Lの緩衝生理食塩水）でトリプシンを中和し、0.05％トリプシン/ EDTAで培養フラスコからヒトケラチノサイトをトリプシン処理、培地を再構成皮膚の4.17 × 10 6細胞/ mLで細胞ペレットを再懸濁し、スピンダウンI. 培地I.を再建皮膚0.83 × 10 6細胞/ mLで細胞ペレットを再懸濁し、スピンダウン、大豆トリプシンインヒビターとトリプシンを中和し、0.05％トリプシン/ EDTAで培養フラスコからヒトメラニン細胞または黒色腫細胞をトリプシン処理各インサートの内側と外側の両方から培地を洗濯取り外します。 皮膚が培地I（各インサートの外側に内側と10 mLの1.5 mL）を再追加。 、ケラチノサイトとメラノサイトまたはメラノーマ細胞の600μlの細胞懸濁液の600μlの細胞懸濁液を取るよく混ぜる。各インサートの内側にドロップして200μlの混合細胞懸濁液のドロップを分注する。皮膚幹細胞の場合は、再構成するケラチノサイト懸濁液100μlをのみ使用します。 37℃で2日間インキュベート℃に私培地を再構築皮膚を吸引除去する内側と各インサートの外側の両方から。培地IIに（内側から2 mLおよび外側に10 mL）を再構成皮膚を追加。 37℃でさらに2日間インキュベート℃に吸引皮膚は内側から培地IIを再構成し、各インサートの外側には、7.5mlのスキンは外側だけに培地IIIを再追加。この点から、表面が空気にさらされている開始再構成する。 18日目まで一日おきに培地IIIを変更します。 収穫の皮膚は、一日18で再構築： 内側とインサートの外側から培地を吸引除去する。 ピンセットでトレイからインサートを取り外します。 手術用メスの刃で端に円形の近くにトレースすることで（ポリカーボネートフィルターを含む）の再構築を切り取ります。 ハード面で再構築し、半分にフィルターをカット。 パラフィン切片の場合：2黒TBS生検の論文との間の組織学のカセットに再構築し、4時間以上10％ホルマリンで全体のカセットを浸漬の半分を置きます。その後70％エタノールでカセットを配置し、それを4℃で保存して、パラフィン包埋のために再処理するための準備が整うまで。 凍結切片の場合： の他の半分を置きます4で50％のショ糖で再構築° Cを1〜2時間、その後2Mにショ糖を変更し、別の1〜2時間4℃に保存。 それは船の約50％を埋めるように使い捨てのベース金型に最適な加工温度の凍結媒体（OCT）を分注する。 OCTのいずれかの泡を避けてください。 鉗子で再構築し、スクロースから再構築削除のエッジをつかむ。キムワイプはショ糖を吸収するまでキムワイプの上に置きます。 鉗子やヘラを使用して、OCTの上にベースの金型に再構築を移す。ベースの金型が完全にいっぱいになるまで多くのOCTで再構築の上部をカバーしています。あなたが困難にカットできるようになりますOCTでいかなる気泡がないことを確認してください。 砕いたドライアイス上で均等に基本型を置き、そして、OCTは完全に凍結することができます。 スズ箔で基本型をラップし、それを-70℃で保存するクライオスタットでそれを切る準備が整うまで。 移植皮膚は、マウスで再構築： DMEMの5mLの（凍結と解凍のマウスの皮膚用）と50 mLのファルコンチューブを準備します。 6週間前後雌SCIDへアレス非近交系マウスを使用してください。 マウスは、イソフルランで麻酔です（EZ麻酔システム）：最初の麻酔は、イソフルラン4％（マウスが手術台に移動される前）で誘導チャンバ内で行われ、手続き時にノーズコーンブリーザーによって麻酔を維持している（イソフルラン：1.5〜2パーセント）。低体温麻酔時の眼の怪我を防ぐために適用される無菌眼科用潤滑油を防止するために、加熱パッドにより熱のサポート。 ビーカーに600mlの水を入れ、40との間に水の温度を保つためにホットプレートの上に残す – 60℃ 複合ベンゾインチンキとアルコールの準備を綿棒でマウスの皮膚をきれいにします。 後で縫合のために同じ位置を維持するために、マウスの背中の上に行をマーク。 アイリスのハサミとピンセットを用いて、マウス上部の背面に直径1.2 cm程度の円形創傷床をカット。滅菌ガーゼのスポンジを創傷床をカバーしています。 DMEM 5mLに丸いマウスの皮膚を置く、それは完全に凍結するまで液体窒素の容器のまま。霜取りは、ホットプレートの上にお湯の管が完全に融解するまで。 3回繰り返します。 皮膚のトランスウェルを使用して外科ブレードから再構築し、非常に慎重に膜を除去デタッチ、創傷床の上に（上表皮側）を再構築皮膚を転送する。 皮膚の再構築の上にマウスの皮膚（上表皮側）を配置します。 マウスの皮膚を修正するためにして、以前にラベルを付けたマーカーの最初の縫合、底部の2番目、両側にある2個以上の縫合を行う。 移植後のクリーンマウスの皮膚。ノーズコーンを外し、目を覚まし、外来まで加熱パッド上でマウスを保持します。 新しいケージにマウスを置く。 手術直後は皮下注射、手術後24時間および48時間でメロキシカム（1 mg / kg体重）：手術鎮痛を投稿。 2。代表的な結果： 皮膚は、正常メラノサイトと皮膚幹細胞で再構築 皮膚は、インサート付き特別6穴トレイで培養され再構築されます。皮膚コンパートメントは、最初の4日間（図1A）のために10％FBSを含むDMEM中で培養される。皮膚は、角化細胞がメラ​​ノサイトまたはメラノーマ細胞（図1B）を播種しているときに私が使用されている培地再構築。表皮は、9日目で空気にさらされると、これは角化細胞が分化することができます（図1C）されています。 18日目で、皮膚の表皮は、階層化ケラチノサイトの層で構成されて再構築。未分化基底層と連続して差別化された層は、（図1D）に縦に並んでいます。染色メラノサイトのマーカーS100で再構築のセクションを覆うとそのメラノサイトがデンドライト拡張機能を介して複数のケラチノサイトと表皮と通信の基底層（図1E）に整列されて表示されます。皮膚コンパートメントは、I型コラーゲンマトリックスに埋め込まれている線維芽細胞が含まれています。堆積コラーゲンIVは、真皮（図1F）から表皮を分離する基底膜を、示している。皮膚幹細胞（GFPレンチウイルスベクターで標識）コラーゲンIマトリックスの線維芽細胞に埋め込まれている場合、それらは表皮に移行し、メラノサイト（1）、（図2）に分化する。表皮のケラチノサイトの複数の層が開発されています。 皮膚は黒色腫の腫瘍の再構築 一般的な買収母斑、異形成母斑、RGP（放射状増殖相）メラノーマ、VGP（垂直増殖期）黒色腫と転移性黒色腫（7）：臨床病理学的研究は、段階的にその黒色腫の進行状況を示します。メラノーマ細胞株の異なる段階では、2次元文化の中でお互いに形態学的に似ています（図3A – D）が、それらが皮膚再構築に組み込まれているときに、細胞の挙動は、彼らの中のin vivoでの特性を反映している。場所と正常メラノサイトの成長率は、しっかりと皮膚の再構築（図3E）で制御されます。 VGPメラノーマWM793は真皮（図3G）に侵襲的に成長するのに対し、RGP主メラノーマWM35は、表皮（図3F）で主に増殖する。転移性黒色腫1205Luは積極的に真皮（図3H）の奥深くまで侵入する。 図1。皮膚は、正常メラノサイトで再構築する。皮膚の肉眼的形態は、ACに示されている再構築する。コラーゲンと混合A.の線維芽細胞を10％FBSおよびフォーム皮膚コンパートメントを含むDMEM中で増殖されています。 B.のケラチノサイトとメラノサイトが真皮の上に播種し、培地を再構築皮膚に成長されています。 C.表皮は、9日目で空気にさらされている。 D. H＆E染色皮膚再構築は、垂直に構成される表皮、指向基底層、および順次分化した層化細胞層を示す。真皮は、コラーゲンI型マトリックス中に埋め込まれた線維芽細胞が含まれています。 E. S100陽性メラノサイト（黒矢印）は、複数のケラチノサイトと基底膜との通信で整列される。 F.コラーゲンIV -染色では、真皮から表皮を分離する基底膜を、示している。 DFのすべてstainingsは、ホルマリン固定、パラフィン包埋切片で行った。 図2。皮膚の真皮幹細胞は、表皮に移行し、メラノサイトに分化再構築します。5日目に播種ケラチノサイトの後、単一のGFP陽性細胞（緑）が球からの移行を開始。表皮は、まだ単層で構成されています。 8日目では、少数の細胞は表皮 – 真皮のインタフェースに到達する。 10日目では、GFP陽性細胞がしっかりと基底膜の位置に配置されます。移行したGFP陽性表皮エクスプレスメラノサイトのマーカーHMB45の細胞（赤、のような白い矢印で示す）。核はDAPI（青）で染色されています。表皮は、複数の層として開発されています。基底膜は白い点線で示されます。 図3。皮膚は黒色腫のさまざまな段階の再構築：AD。正常メラノサイトおよびメラノーマ細胞は、2次元培養液内で成長する。包皮からAはメラノサイト。 B. RGP WM35細胞。 C. VGP WM793細胞。 D.転移性メラノーマ1205Lu細胞。 E.正常メラノサイトは、基底膜に位置しています。 F. RGPメラノーマWM35細胞は表皮の細胞のクラスターとして成長する。 G. VGPメラノーマWM793細胞が基底膜を介して真皮に侵入。 H.転移性黒色腫1205Lu細胞が積極的に真皮に深く侵入する。 トラブルシューティング 問題が トラブルシューティング コラーゲンの混合物は固化していないコラーゲンの混合物の色がピンクに藁の黄色でなければならない、そうでなければpHが間違っているとコラーゲンゲルではない場合があります。色は明るい黄色である場合は、より多くの重炭酸ナトリウムは、滴ずつ追加する必要があります。 コラーゲンは、途中でmixutureに析出コラーゲンの混合物をインサートの上に配置されるまで氷の上ですべてのコンポーネントを置かないでください契約コラーゲンは（片側が反対側よりも厚くなる）にもないインキュベーターの棚のキャリブレーション表皮は、つ以下ケラチノサイトの層が形成されている。 下の通路で未分化ケラチノサイトを使用してください