עור תלת ממדי האדם לשחזר דגם: ככלי מחקר עור רגיל התקדמות מלנומה

1. עור תלת ממדי האדם לשחזר דגם: הכנת שכבת acellular: מערבבים את ריאגנטים הבאים שפופרת 50 מ"ל על הקרח: 0.59 EMEM מ"ל 10X, 50 μl 200mm L-גלוטמין, 0.6 מ"ל FBS, 120 סודיום ביקרבונט μl 7.5% ו 4.6 מ"ל שור קולגן I. הוסף 1 מ"ל של להכניס את התערובת לתוך כל אחד מגשים בתרבית רקמה. דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ולאפשר הג'ל לחזק. צבע של התערובת צריכה להיות מתוך קש צהוב וורוד. Trypsinize fibroblasts האדם מן התרבות צלוחיות עם 0.25% טריפסין / EDTA, להוסיף DMEM המכיל 10% FBS לנטרל. איסוף תאים על ידי צנטריפוגה ו resuspend 0.45 x 10 6 תאים 1.5 מ"ל DMEM עם 10% FBS. עבור בתאי גזע עורי, לאסוף 6600 תחומי עורי (כאשר בתאי גזע עורי לגדול בינוני תא גזע, הם יוצרים כדורים באופן דומה neurospheres) על ידי לחיצה על הבקבוק כדי לנתק את הספירות, צנטריפוגה. הכנת שכבת הסלולר: מערבבים את הבאים שפופרת 50 מ"ל על הקרח: 1.65 מ"ל EMEM 10X, 150 μl 200 מ"מ L-גלוטמין, 1.85 מ"ל FBS, 350 סודיום ביקרבונט μl 7.5%, 14 מ"ל שור קולגן I ו 1.5 מ"ל ההשעיה fibroblasts משלב 2 (לחילופין, להשתמש בשילוב של 0.45 x 10 6 ו 6600 fibroblasts תחומי עורי ב 1.5 מ"ל של העור לשחזר בינוני אני עבור תא גזע עורי משחזר), ומערבבים היטב. הוסף 3 מ"ל של התערובת להכניס כל שכבה מצופה acellular. דגירה של 45 דקות ב 37 מעלות של 5% CO 2 רקמות התרבות בחממה. צבע של התערובת צריכה להיות מתוך קש צהוב וורוד. אחרי הג'ל מחזקת, להוסיף DMEM FBS המכיל 10% (2 בתוך מ"ל ו – 10 מ"ל של הכנס מחוץ היטב כל אחד לשחזר מגשי עור). דגירה של 4 ימים לוודא כי חוזים ג'ל. לשאוב בינוני מבפנים והן מחוץ להכניס כל אחד. הוסף כביסה בינוני (HBSS עם 1% dialyzed FBS) 2 מ"ל הפנימי ו 10 מ"ל החיצוני של הכנס על מנת לשטוף קבוע בסרום. דגירה במשך שעה 1 ב 37 ° C. הכנת העור לשחזר בינוני: עבור תא נורמלי גזע מלנוציט ואת עורי משחזר: כדי להפוך את אמצעי בסיסי (500 מ"ל), לערבב את ריאגנטים הבאות: 490 מ"ל סרום keratinocyte ללא בינוני, 1.8 מ"ל תמצית בלוטת יותרת המוח שור, 10 מ"ל dialyzed בסרום שור עוברית, 500 μl של 10 מיקרוגרם / מ"ל SCF, 562.5 μl של 4 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו – 500 μl bFGF של 264 מיקרוגרם / מ"ל ​​ET-3. אני בינוני: הוסף 10 μl של EGF בינוני 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​ל -100 מ"ל בסיסיים. בינוני II: הוסף 2 EGF μl עד בינוני 100 מ"ל בסיסיים. בינוני III: הוסף 720 μl CaCl 2 של מ 1 עד בינוני 300 מ"ל בסיסיים. עבור העור מלנומה לשחזר: כדי להפוך בינוני אני (100 מ"ל), לערבב את ריאגנטים הבאים: 72.5 מ"ל של DMEM, 24 מ"ל של F12 (HAM זה), 2 מ"ל L-גלוטמין של 200 מ"מ, 200 הידרוקורטיזון μl של 269 גרם / מ"ל, 200 ITES μl של 500X, 200 μl O-phosphorylethanolamine של 0.05 מ ', 200 אדנין μl של 90 מ"מ, 200 הפרוגסטרון μl של 2 ננומטר, 240 μl CaCl 2 של 1 מ', 200 triiodothyronine μl של 10 ננומטר 100 μl של נסיוב chelexed עגל בן יומו (להמיס 3 גר 'של Chelex 100 ב 100 מ"ל של סרום, מערבבים 1.5 שעות ב 4 ° C, מסנן לעקר). כדי להפוך בינוני II (100 מ"ל), לערבב את ריאגנטים הבאים: 72.5 מ"ל של DMEM, 24 מ"ל של F12 (HAM זה), 2 מ"ל L-גלוטמין של 200 מ"מ, 200 הידרוקורטיזון μl של 269 גרם / מ"ל, 200 ITES μl של 500X, 200 μl O-phosphorylethanolamine של 0.05 מ ', 200 אדנין μl 90 מ"מ, 200 הפרוגסטרון μl של 2 ננומטר, 240 CaCl2 μl של 1 מ', 200 triiodothyronine μl של 10 ננומטר 100 μl נסיוב עגל בן יומו. כדי להפוך בינוני III (300 מ"ל), לערבב את ריאגנטים הבאים: 142.5 מ"ל של DMEM, 142.5 מ"ל של F12 (HAM זה), 6 מ"ל של גלוטמין-L של 200 מ"מ, 600 הידרוקורטיזון μl של 269 גרם / מ"ל, 600 ITES μl של 500X , 600 μl O-phosphorylethanolamine של 0.05 מ ', 600 אדנין μl 90 מ"מ, 600 הפרוגסטרון μl של 2 ננומטר, 720 μl CaCl 2 של 1 מ', 600 triiodothyronine μl של 10 ננומטר ו 6 נסיוב עגל בן יומו מ"ל. Trypsinize קרטינוציטים האדם מן התרבות צלוחיות עם 0.05% טריפסין / EDTA, לנטרל טריפסין עם סויה, שעועית מעכב טריפסין (250 מ"ג / ליטר ב פוספט 1x שנאגרו מלוחים), ספין למטה, resuspend תא גלולה בשעה 4.17 x10 6 תאים / מ"ל בעור לשחזר בינוני I. Trypsinize מלנוציטים אדם או בתאי מלנומה מן התרבות צלוחיות עם 0.05% טריפסין / EDTA, לנטרל טריפסין עם מעכבי טריפסין שעועית סויה, ספין למטה, resuspend תא גלולה בשעה 0.83 x10 6 תאים / מ"ל בעור לשחזר I. בינוני הסר כביסה בינוני מבפנים והן מחוץ להכניס כל אחד. הוסף העור לשחזר בינוני אני (1.5 מ"ל הפנימי ו 10 מ"ל החיצוני של להכניס כל אחד). קח 600 ההשעיה תא μl של קרטינוציטים ו 600 ההשעיה תא μl של תאים מלנוציטים או מלנומה, ומערבבים היטב. לוותר על 200 ההשעיה μl מעורבת תא טיפה אחר טיפה הפנימי של להכניס כל אחד. עבור תא גזע עורי לשחזר, להשתמש 100 μl של השעיה keratinocyte בלבד. דגירה עבור 2 ימים 37 ° C. העור ישאפו לשחזר בינוני אנימבפנים וגם מבחוץ להכניס כל אחד. הוסף העור לשחזר בינוני II (2 מ"ל הפנימי ו 10 מ"ל החוצה). דגירה לעוד 2 ימים 37 ° C. העור ישאפו לשחזר II בינוני מבפנים מחוץ להכניס כל אחד, להוסיף 7.5 מ"ל לעור לשחזר III בינוני החוצה בלבד. מנקודה זו, את פני השטח של משחזר מתחיל להיות חשוף לאוויר. שינוי המדיום השלישי בכל יום אחר יום עד 18. העור קציר לשחזר ביום 18: לשאוב התקשורת מבפנים מחוץ מוסיף. הסר מוסיף ממגש עם מלקחיים. חותכים את לשחזר (כולל פילטר פוליקרבונט) על ידי התחקות קרוב לקצה המעגל עם להב אזמל. חותכים את לשחזר את מסנן במחצית על משטח קשה. עבור חלקים פרפין: במקום מחצית לשחזר בקלטת היסטולוגיה בין 2 שחור ניירות כפות ביופסיה ולספוג את הקלטת כולה ב -10% פורמלין במשך יותר מ 4 שעות. אז במקום את הקלטת אתנול 70% ולאחסן אותו על 4 מעלות צלזיוס עד שאתה מוכן לתהליך לשחזר להטבעת פרפין. עבור חלקים קפואים: מניחים את החצי השני של לשחזר ב סוכרוז 50% ב 4 מעלות צלזיוס במשך 1-2 שעות, ולאחר מכן לשנות את סוכרוז כדי 2M ולאחסן אותו ב 4 ° C למשך 1-2 שעות. לוותר האופטימלי לחיתוך הקפאה בטמפרטורה התקשורת (אוקטובר) לתוך תבנית בסיס חד פעמי כך שתמלא כ -50% סירה. הימנע מכל בועות אוקטובר תפוס את קצה של לשחזר עם מלקחיים ולהסיר את לשחזר מסוכרוז. מניחים אותו על Kimwipes עד Kimwipes לספוג את סוכרוז. העברת לשחזר לתוך תבנית הבסיס על גבי אוקטובר, באמצעות מלקחיים מרית. מכסים את החלק העליון של לשחזר עם יותר אוקטובר עד עובש בסיס מלא לחלוטין. ודא שיש לך אין שום בועות אוקטובר שיגרום קיצוץ קשה. מניחים את התבנית באופן שווה על בסיס קרח יבש כתוש, ולאפשר אוקטובר להקפיא לחלוטין. עוטפים את התבנית בנייר כסף בסיס פח ולאחסן אותו ב -70 מעלות צלזיוס עד שאתה מוכן לחתוך אותו עם cryostat. שתל עור לשחזר על עכבר: הכן 50 מ"ל בז צינורית עם 5 מ"ל של DMEM (להקפאה ועכבר העור הפשרה). השתמש בעכבר נקבה SCID outbred שיער סביב 6 שבועות. העכבר הוא הרדים עם (מערכת EZ הרדמה) isoflurane: הרדמה הראשוני מתבצע בחדר אינדוקציה עם הרדמה 4% isoflurane (לפני הזזת העכבר למיטה כירורגית) ולשמור על דרך הנשם nosecone במהלך ההליך (isoflurane: 1.5-2% ). מחממים תמיכה על ידי כרית מחומם כדי למנוע היפותרמיה ו חומר סיכה עיניים סטריליות ליישם כדי למנוע פגיעה עינית במהלך ההרדמה. מכניסים 600 מ"ל מים בכוס ולהשאיר על גבי צלחת חמה לשמור טמפרטורת המים בין 40-60 ° C. נקו את עור העכבר עם תמיסת מתחם הבנזואין ו הכנה מטליות אלכוהול. סמן קו על גבי גב בעכבר כדי לשמור על מיקום זהה עבור תפירת מאוחר יותר. גזור מיטה פצע סביב 1.2 ס"מ קוטר על גבי העכבר העליון באמצעות מספריים איריס מלקחיים. כיסוי המיטה הפצע עם ספוגים גזה סטרילי. שים את העור עכבר עגול 5 מ"ל של DMEM, אז להשאיר במיכל חנקן נוזלי עד קפוא לחלוטין. הפשירו הצינור במים חמים על גבי צלחת חמה עד מופשר לחלוטין. חזור 3 פעמים. ניתוק העור לשחזר מן transwell בעזרת להב כירורגי ולהסיר את הקרום בזהירות רבה, העברת העור לשחזר (בצד את האפידרמיס) על גבי הפצע. מניחים את עור העכבר (צד האפידרמיס ומעלה) על גבי העור לשחזר. הפוך את תפר הראשון סמן שכותרתו בעבר, השני על הקרקעית, ולאחר מכן שני תפרים יותר משני כדי לתקן את העור העכבר. העכבר לאחר השתלת עור נקי. הסר nosecone ולשמור העכבר על משטח מחומם עד ער אמבולטורי. שים את העכבר לכלוב חדש. הודעה כאבים אופרטיבית: Meloxicam (1 מ"ג / ק"ג) על ידי הזרקה תת עורית מיד לאחר הניתוח, 24 שעות ו 48 שעות לאחר הניתוח. 2. נציג תוצאות: העור משחזר עם מלנוציטים נורמליים בתאי גזע עורי העור משחזר הם בתרבית מגש 6-היטב מיוחד עם מוסיף. תא עורי הוא בתרבית DMEM עם FBS 10% בארבעת הימים הראשונים (איור 1A). העור לשחזר בינוני אני משמש כאשר קרטינוציטים הם זורעים עם במלנוציטים או בתאי מלנומה (איור 1B). האפידרמיס הוא חשוף לאוויר ביום 9 וזה מאפשר קרטינוציטים להבדיל (איור 1C). באותו יום 18, האפידרמיס של העור משחזר מורכב keratinocyte מרובדת שכבות. שכבת הבסיס מובחן שכבות הבדיל ברצף הם בכיוון אנכי (1D איור). כתםing את קטע משחזר עם melanocytic סמן S100 מראה כי מלנוציטים מיושרים בשכבת הבסיס של האפידרמיס ולתקשר עם קרטינוציטים מרובים באמצעות הרחבות דנדריט (איור 1E). תא עורי מכיל fibroblasts מוטבע סוג קולגן אני מטריקס. שהופקד קולגן IV מציין את קרום במרתף, המפריד בין האפידרמיס מן הדרמיס (איור 1F). כאשר בתאי גזע עורי (שכותרתו עם GFP lentiviral וקטור) המוטבעים עם fibroblasts ב קולגן אני מטריקס, הם נודדים אל האפידרמיס להתמיין מלנוציטים (1), (איור 2). שכבות מרובות של קרטינוציטים של האפידרמיס מפותחים. העור משחזר של גידולים מלנומה מחקרים מצביעים על כך Clinicopathological מלנומה התקדמות באופן הדרגתי: nevi רכש משותף, שומות nevi, RGP (שלב הצמיחה רדיאלי) מלנומה, VGP (שלב הצמיחה אנכי) מלנומה גרורתית מלנומה ו (7). בשלבים שונים של שורות תאים מלנומה דומים זה לזה מורפולוגית בתרבות D-2 (איור 3A-D) אבל כשהם משולבים בעור משחזר, את התנהגותם של תאים משקף שלהם מאפיינים vivo. המיקום ואת קצב הגידול של מלנוציטים נורמליים נשלטים בחוזקה בעור משחזר (איור 3E). RGP העיקרי מלנומה WM35 להתרבות בעיקר האפידרמיס (איור 3F), ואילו VGP מלנומה WM793 לגדול פולשני לתוך הדרמיס (איור 3G). מלנומה גרורתית 1205Lu באגרסיביות לחדור עמוק לתוך הדרמיס (איור 3H). באיור 1. העור משחזר עם מלנוציטים נורמליים. המראה ברוטו של העור משחזר מוצג AC. Fibroblasts א מעורבב עם קולגן מגדלים DMEM המכיל 10% FBS וליצור תא עורי. קרטינוציטים ב ו מלנוציטים הם זורעים על גבי הדרמיס ולגדול בעור לשחזר בינוני. ג האפידרמיס הוא חשוף לאוויר ביום 9. ד H & E מוכתם העור לשחזר מציג את האפידרמיס מורכבת במאונך, שכבת הבסיס בכיוון, הבדיל ברצף תא מרובדת שכבות. הדרמיס מכיל fibroblasts מוטבע סוג קולגן אני מטריקס. ה-S100 חיובי מלנוציטים (חיצים שחורים) מיושרים על קרום המרתף ולתקשר עם קרטינוציטים מרובים. פ קולגן IV-מכתים מצביע על קרום במרתף, המפריד בין האפידרמיס של הדרמיס. כל stainings ב DF בוצעו על פורמלין-קבוע, פרפין, משובצים קטעים. איור 2. בתאי גזע Dermal בעור משחזר להגר האפידרמיס להתמיין מלנוציטים. באותו יום 5 אחרי קרטינוציטים זריעה, תאים GFP חיובי אחד (ירוק) להתחיל נודדות מן התחומים. האפידרמיס מורכב עדיין בשכבה אחת. באותו יום 8, מספר תאים להגיע ממשק האפידרמיס, הדרמיס. ביום 10, GFP חיובי תאים מיושרים היטב במיקום קרום המרתף. GFP חיובי היגרו התאים את הסמן האפידרמיס melanocytic להביע HMB45 (אדום, כפי שצוין על ידי חצים לבנים). גרעינים מגואלות DAPI (כחול). האפידרמיס הוא התפתח שכבות מרובות. קרום המרתף מצוין עם קווים מקווקווים לבן. איור 3. העור משחזר שלבים שונים של מלנומה: AD. מלנוציטים נורמליים ותאי מלנומה גדלו בתרבויות 2D. א מלנוציטים מן העורלה. ב RGP WM35 התאים. ג VGP WM793 תאים. ד 1205Lu מלנומה גרורתית תאים. מלנוציטים E. רגיל ממוקמים קרום המרתף. פ RGP WM35 התאים מלנומה לגדול ככל אשכולות תא האפידרמיס. ג VGP WM793 בתאי מלנומה לפלוש לתוך הדרמיס דרך הממברנה במרתף. ח גרורתי 1205Lu בתאי מלנומה אגרסיבית לפלוש עמוק לתוך הדרמיס. פתרון בעיות בעיה פתרון בעיות תערובת קולגן אינה לחזק תערובת צבע קולגן צריך להיות קש צהוב ורוד, אחרת ה-pH לא בסדר קולגן עלול לא ג'ל. אם הצבע הוא צהוב בהיר, סודיום ביקרבונט יותר יש להוסיף טיפה אחר טיפה. קולגן בטרם עת משקעים ב mixuture שמור את כל המרכיבים על קרח עד תערובת קולגן מושם על הוספת קולגן הוא אפילו לא חוזה (צד אחד עבה יותר בצד השני) כייל את המדף של חממה האפידרמיס נוצר עם פחות משלוש שכבות keratinocyte. השתמש קרטינוציטים מובחן על קטעים נמוך