La peau Three-Dimensional Human Reconstruire Modèle: un outil pour étudier la peau normale et la progression du mélanome

1. La peau Three-Dimensional Human Reconstruire Modèle: Préparation de la couche acellulaire: Mélanger les réactifs suivants dans un tube de 50 ml sur glace: 0,59 ml EMEM 10X, 50 pl 200 mM L-glutamine, 0,6 ml de FBS, 120 bicarbonate de sodium ul de 7,5% et 4,6 mL collagène bovin I. Ajouter 1 mL de le mélange dans chaque insert de plateaux de culture de tissus. Incuber pendant 30 min à température ambiante et permettre au gel de se solidifier. Couleur du mélange doit être de couleur jaune paille au rose. Trypsiniser fibroblastes humains à partir des flacons de culture avec 0,25% de trypsine / EDTA, ajouter DMEM contenant 10% de FBS à neutraliser. Recueillir les cellules par centrifugation et resuspendre 0,45 x 10 6 cellules dans 1,5 ml de DMEM avec 10% de FBS. Pour les cellules souches dermiques, de collecter 6600 sphères dermique (lorsque les cellules souches dermiques croître en moyenne de cellules souches, ils forment des sphères d'une manière similaire à neurosphères) en tapant flacon pour détacher les sphères, la centrifugation. Préparation de la couche cellulaire: Mélanger les éléments suivants dans un tube de 50 ml sur glace: 1,65 ml EMEM 10X, 150 pl 200 mM L-glutamine, 1,85 ml de FBS, 350 bicarbonate de sodium ul de 7,5%, 14 ml collagène I bovin et 1,5 mL de suspension de fibroblastes partir de l'étape 2 (alternativement, utilisez la combinaison de 0,45 x 10 6 fibroblastes dermiques et 6600 sphères dans 1,5 ml de la peau de reconstituer milieu I sur les cellules souches dermiques reconstruit), bien mélanger. Ajouter 3 ml du mélange à chaque couche de revêtement acellulaire insérer. Incuber pendant 45 min à 37 ° C dans un 5% de CO 2 incubateur de culture tissulaire. Couleur du mélange doit être du jaune paille au rose. Après le gel se solidifie, ajoutez DMEM contenant 10% de FBS (2 à l'intérieur ml et 10 ml de l'extérieur de l'insérer dans chaque puits de la peau de reconstituer les plateaux). Incuber pendant 4 jours et faire en sorte que les contrats de gel. Aspirer moyennes de l'intérieur et l'extérieur de chaque insert. Ajouter milieu de lavage (HBSS avec 1% de FBS dialysé) 2 mL à l'intérieur et 10 ml à l'extérieur de l'insert afin de laver le sérum normal. Incuber pendant 1 heure à 37 ° C. Préparation de la peau de reconstituer moyennes: Pour des cellules souches normales mélanocytes et cutanée reconstruit: Pour rendre milieu basique (500 ml), mélanger les réactifs suivants: 490 ml kératinocytes milieu sans sérum, 1,8 ml d'extrait hypophyse bovine, 10 mL dialysées sérum fœtal bovin, 500 pi de 10 ug / mL EFC, 562,5 ul de 4 pg / ml de bFGF et 500 ul de 264 pg / ml HE-3. Milieu I: Ajouter 10 ul d'EGF 100 pg / mL à 100 mL de milieu de base. Milieu II: Ajouter 2 EGF ul à 100 mL de milieu de base. Medium III: Ajouter 720 ul de CaCl 2 1 M à 300 ml de milieu de base. Pour la peau sans mélanome reconstruire: Pour faire Milieu I (100 ml), mélanger les réactifs suivants: 72,5 ml de DMEM, 24 ml de F12 (HAM), 2 ml de L-glutamine de 200 mm, 200 hydrocortisone ul de 269 g / mL, 200 ITES ul de 500X, 200 pl O-phosphorylethanolamine de 0,05 m, 200 adénine ul de 90 mm, 200 progestérone ul de 2 nM, 240 ul de CaCl 2 1 M, 200 Triiodothyronine ul de 10 nM et 100 pl de sérum de veau nouveau-né chelexed (dissoudre 3 g de Chelex 100 dans 100 ml de sérum, mélanger 1,5 heures à 4 ° C, stériliser par filtration). Pour faire Milieu II (100 ml), mélanger les réactifs suivants: 72,5 ml de DMEM, 24 ml de F12 (HAM), 2 ml de L-glutamine de 200 mm, 200 hydrocortisone ul de 269 g / mL, 200 ITES ul de 500X, 200 pi O-phosphorylethanolamine de 0,05 m, 200 adénine ul de 90 mm, 200 progestérone ul de 2 nM, 240 ul de CaCl2 de 1 M, 200 Triiodothyronine ul de 10 nM et 100 ul de sérum de veau nouveau-né. Pour faire Medium III (300 ml), mélanger les réactifs suivants: 142,5 ml de DMEM, 142,5 ml de F12 (HAM), 6 ml de L-glutamine de 200 mm, 600 hydrocortisone ul de 269 g / mL, 600 ITES ul de 500X , 600 O-ul phosphorylethanolamine de 0,05 M, 600 adénine ul de 90 mm, 600 progestérone ul de 2 nM, 720 ul de CaCl 2 1 M, 600 Triiodothyronine ul de 10 nM et 6 ml de sérum de veau nouveau-né. Trypsiniser kératinocytes humains des flacons de culture avec 0,05% de trypsine / EDTA, neutraliser la trypsine de soja avec des inhibiteurs de la trypsine (250 mg / L en 1x tampon phosphate salin), ralentit, resuspendre un culot cellulaire à 4,17 x10 6 cellules / ml dans la peau de reconstituer moyennes I. Trypsiniser mélanocytes humains ou des cellules de mélanome de flacons de culture avec 0,05% de trypsine / EDTA, neutraliser la trypsine de soja avec inhibiteur de la trypsine, ralentit, resuspendre un culot cellulaire à 0,83 x10 6 cellules / ml dans la peau de reconstituer moyennes I. Retirer milieu de lavage de l'intérieur et l'extérieur de chaque insert. Ajouter la peau de reconstituer milieu I (1,5 ml à l'intérieur et 10 ml à l'extérieur de chaque insert). Prenez 600 ul suspension cellulaire des kératinocytes et 600 l de suspension cellulaire mélanocytes ou cellules de mélanome, bien mélanger. Distribuer 200 ul goutte mélangée suspension cellulaire à goutte à l'intérieur de chaque insert. Pour reconstruire les cellules souches dermiques, utiliser 100 pl de suspension de kératinocytes seulement. Incuber pendant 2 jours à 37 ° C. Aspirer la peau de reconstituer milieu Ià la fois de l'intérieur et l'extérieur de chaque insert. Ajouter la peau de reconstituer milieu II (2 ml à l'intérieur et 10 mL à l'extérieur). Incuber pendant 2 jours à 37 ° C. Aspirer la peau de reconstituer milieu II de l'intérieur et l'extérieur de chaque insert, ajouter 7,5 ml de reconstruire la peau moyennes III que l'extérieur. De ce point, la surface des reconstruit commence à être exposé à l'air. Changer milieu III tous les autres jours jusqu'au jour 18. Récolte de peau reconstruire à jour 18: Aspirer des médias de l'intérieur et l'extérieur des inserts. Retirer insère à partir du bac avec une pince. Découpez la reconstruction (y compris le filtre en polycarbonate), en traçant un cercle de proches du bord avec une lame de bistouri. Couper le reconstruire et le filtre dans la moitié sur une surface dure. Pour les sections de paraffine: placer une moitié de la reconstruire dans une cassette d'histologie entre 2 papiers noir biopsie du SCT et laisser tremper toute la cassette dans le formol à 10% pendant plus de 4 heures. Ensuite, placez la cassette dans l'éthanol à 70% et le stocker à 4 ° C jusqu'à ce que vous êtes prêt à traiter les reconstituer pour inclusion dans la paraffine. Pour les sections congelées: Placez l'autre moitié de reconstruire 50% de saccharose à 4 ° C pendant 1-2 heures, puis changer le saccharose à 2M et le stocker à 4 ° C pour un autre 1-2 heures. Distribuer optimale de coupe des médias température de congélation (PTOM) dans un moule de base jetables afin qu'il remplisse d'environ 50% du bateau. Eviter les bulles dans les PTOM. Prenez le bord de la reconstruire avec une pince et retirer le reconstruire à partir du saccharose. Placez-le sur Kimwipes jusqu'à la Kimwipes absorber le saccharose. Transférer la reconstruire dans le moule de base au-dessus de l'OPO, l'aide de pinces et une spatule. Couvrez le haut de la reconstruire avec plusieurs PTOM jusqu'à ce que le moule de base est complètement plein. Assurez-vous que vous n'avez pas toutes les bulles dans les PTOM qui fera de coupe difficile. Placez le moule de base uniformément sur la glace sèche broyé, et de permettre aux PTOM de geler complètement. Envelopper le moule de base dans une feuille d'étain et le stocker à -70 ° C jusqu'à ce que vous êtes prêt à le couper avec un cryostat. Greffer une peau de reconstruire sur une souris: Préparer un tube Falcon de 50 ml avec 5 ml de DMEM (pour la congélation et la décongélation peau de souris). Utilisez une femelle consanguine SCID souris sans poils autour de 6 semaines. La souris est anesthésiée avec (système d'anesthésie EZ) isoflurane: l'anesthésie initiale est effectuée dans la chambre de l'induction de l'anesthésie 4% d'isoflurane (avant la souris est déplacé vers le lit chirurgical) et à maintenir grâce à une pause pendant la procédure de coiffe (isoflurane: 1,5-2% ). Le soutien de chaleur par un coussin chauffant pour prévenir l'hypothermie et lubrifiant ophtalmique stérile appliquée pour prévenir les blessures oculaires lors d'une anesthésie. Mettez 600 ml d'eau dans un bécher et laisser sur le dessus d'une plaque chauffante pour maintenir la température de l'eau entre 40 – 60 ° C. Nettoyer la peau des souris avec de la teinture de benjoin composé et tampons à l'alcool. Tracez une ligne sur le dessus du dos de la souris pour garder la même position pour les points de suture plus tard. Couper un lit enroulé autour d'environ 1,2 cm de diamètre sur le dos de souris supérieure en utilisant des ciseaux et des pinces à Iris. Couvrir le lit de la plaie avec des compresses de gaze stérile. Mettez la peau de souris rond dans 5 ml de DMEM, puis laisser dans un récipient d'azote liquide jusqu'à ce qu'elle totalement gelé. Décongelez le tube dans l'eau chaude sur le dessus d'une plaque chaude jusqu'à totalement dégelé. Répétez 3 fois. Détachez la peau de reconstituer à l'aide de la transwell lame chirurgicale et retirer la membrane très soigneusement, le transfert de reconstruire la peau (l'épiderme jusqu'à côté) sur le dessus du lit de la plaie. Placez la peau de souris (côté épiderme vers le haut) sur le dessus de la peau reconstruire. Faire la première suture sur le marqueur préalablement marquées, la seconde sur le fond, puis deux points de suture plus sur les côtés pour fixer la peau de souris. Nettoyer la peau de souris après la greffe. Retirez et gardez la souris coiffe sur le pavé chauffé jusqu'à éveillé et ambulatoires. Placez la souris dans une nouvelle cage. Analgésie post-opératoire: meloxicam (1 mg / kg) par injection sous-cutanée immédiatement après la chirurgie, 24 heures et 48 heures après la chirurgie. 2. Les résultats représentatifs: Peau reconstruit avec des mélanocytes normaux et les cellules souches dermiques La peau reconstitue sont cultivées dans un numéro spécial de 6 puits plateau avec inserts. Le compartiment dermique est cultivé dans DMEM avec du FBS à 10% pour les quatre premiers jours (Fig. 1A). La peau de reconstruire milieu I est utilisé lorsque les kératinocytes sont ensemencés avec des mélanocytes ou cellules de mélanome (Fig. 1B). L'épiderme est exposé à l'air au jour 9 et cela permet de différencier les kératinocytes (figure 1C). Au jour 18, l'épiderme de la peau reconstitue est composé de couches stratifiées kératinocytes. La couche basale et indifférencié couches séquentielle différenciés sont orientés verticalement (Fig. 1D). TacheING la section des reconstruit avec le S100 mélanocytaires marqueurs montre que les mélanocytes sont alignées dans la couche basale de l'épiderme et de communiquer avec les kératinocytes par des extensions multiples dendrites (figure 1E). Le compartiment dermique contient des fibroblastes incorporé dans un collagène de type I de la matrice. Déposé le collagène IV indique la membrane basale, qui sépare l'épiderme du derme (Fig. 1F). Lorsque les cellules souches dermiques (étiqueté avec la GFP lentiviraux vecteur) sont intégrés avec des fibroblastes dans une matrice de collagène de type I, ils migrent vers l'épiderme et se différencient en mélanocytes (1), (fig. 2). Plusieurs couches de kératinocytes de l'épiderme sont développés. Peau reconstruit des tumeurs de mélanome Des études indiquent que des progrès clinicopathologiques mélanomes de manière progressive: ordinaires acquises naevus, naevus dysplasique, RGP (phase de croissance radiale) mélanomes, VGP (phase de croissance verticale) mélanomes métastatiques et les mélanomes (7). Différentes étapes de lignées cellulaires du mélanome sont morphologiquement semblables les uns aux autres en 2-D de la culture (Fig. 3A-D), mais quand ils sont incorporés dans la peau reconstitue, le comportement des cellules reflète leurs caractéristiques en vivo. L'emplacement et le taux de croissance des mélanocytes normaux sont étroitement contrôlés dans la peau reconstitue (Fig. 3E). RGP primaires mélanomes WM35 prolifèrent principalement dans l'épiderme (figure 3F), alors que les mélanomes VGP WM793 croissance invasive dans le derme (Fig. 3G). Métastatique des mélanomes 1205Lu agressivement envahissent profondément dans le derme (Fig. 3H). Figure 1. Peau reconstruit avec des mélanocytes normaux. L'apparition massive de la peau reconstitue est montré dans AC. A. Les fibroblastes mélangé avec du collagène sont cultivées dans du DMEM contenant 10% de FBS et la forme du compartiment dermique. Les kératinocytes et les mélanocytes B. sont ensemencées sur le dessus du derme et de grandir dans la peau de reconstituer à moyen terme. C. L'épiderme est exposé à l'air au jour 9. D. H & E-taché la peau de reconstituer l'épiderme présente compose verticalement, orientées couche basale, et séquentiellement couches de cellules différenciées stratifié. Le derme contient des fibroblastes incorporé dans un collagène de type I de la matrice. E. S100-positifs mélanocytes (flèches noires) sont alignés à la membrane basale et communiquer avec des kératinocytes multiples. F. Le collagène IV-coloration indique la membrane basale, qui sépare l'épiderme du derme. Toutes les colorations dans DF ont été effectués sur le formol et inclus en paraffine sections. Figure 2. Les cellules souches cutanée dans la peau reconstitue de migrer vers l'épiderme et se différencient en mélanocytes. A 5 jours après l'ensemencement de kératinocytes, cellules GFP-positives unique (verte) de commencer à migrer hors des sphères. L'épiderme est toujours composée d'une seule couche. Au jour 8, quelques cellules atteindre l'interface épiderme-derme. En 10 jours, la GFP de cellules positives sont étroitement alignés sur la position membrane basale. La GFP-positives ont migré des cellules dans le marqueur épiderme expresse mélanocytaires HMB45 (rouge, comme indiqué par les flèches blanches). Les noyaux sont colorés au DAPI (bleu). L'épiderme est développé sous forme de couches multiples. La membrane basale est indiqué par des lignes blanches en pointillé. Figure 3. Peau reconstruit des différentes étapes de mélanomes: AD. Mélanocytes normaux et les cellules de mélanome cultivées en cultures 2D. Les mélanocytes A. prépuce. B. RGP WM35 cellules. C. VGP WM793 cellules. D. cellules métastatiques 1205Lu mélanome. Mélanocytes normaux E. sont situés à la membrane basale. F. RGP mélanomes WM35 cellules se développent comme des grappes de cellules de l'épiderme. G. VGP mélanomes WM793 cellules envahissent le derme grâce à la membrane basale. H. atteints de mélanome métastatique des cellules 1205Lu agressivement envahissent profondément dans le derme. Dépannage Problème Dépannage Mélange de collagène ne se solidifie pas Couleurs mélange de collagène doit être jaune paille au rose, sinon le pH est mauvais et le collagène ne peut gel. Si la couleur est jaune vif, le bicarbonate de sodium plus devraient être ajoutés goutte à goutte. Le collagène précipite prématurément dans la mixuture Conservez tous les composants sur la glace jusqu'à ce que le mélange de collagène est placée sur l'insert Collagène contractée n'est même pas (un côté est plus épais que l'autre côté) Calibrer le plateau de l'incubateur L'épiderme est formé avec au moins trois couches de kératinocytes. Utilisez kératinocytes indifférenciés à moindre passages