De driedimensionale menselijke huid Reconstrueer model: een instrument om de normale huid en melanoomprogressie Study

1. De driedimensionale menselijke huid reconstrueren Model: Voorbereiding van de acellulaire laag: Meng de volgende reagentia in een 50 ml buis op ijs: 0,59 ml 10x EMEM, 50 ul 200mm L-glutamine, 0,6 ml FBS, 120 pl 7,5% Natriumbicarbonaat en 4,6 ml bovine collageen I. Voeg 1 mL het mengsel in elke insert van weefselkweek trays. Incubeer gedurende 30 minuten op kamertemperatuur en laat de gel te stollen. Kleur van het mengsel moet worden van stro-geel tot roze. Trypsinize menselijke fibroblasten van cultuur flessen met 0,25% trypsine / EDTA, voeg DMEM met 10% FBS te neutraliseren. Verzamel cellen door centrifugeren en resuspendeer 0,45 x 10 6 cellen in 1,5 ml DMEM met 10% FBS. Voor de dermale stamcellen, het verzamelen van 6600 dermale bollen (wanneer dermale stamcellen groeien in stamcellen medium, vormen ze bolletjes op een vergelijkbare manier met neurospheres) door te tikken op fles naar de sferen, centrifugeren los te maken. Voorbereiding van de cellaag: Meng de volgende in een 50 ml buis op ijs: 1,65 ml 10x EMEM, 150 pi 200 mM L-glutamine, 1,85 ml FBS, 350 ul 7,5% Natriumbicarbonaat, 14 ml bovine collageen I en 1,5 mL fibroblasten schorsing uit stap 2 (alternatief, een combinatie van 0,45 x 10 6 fibroblasten en 6600 dermale sferen te gebruiken in 1,5 ml van de huid te reconstrueren medium I voor de huid stamcellen reconstrueert), goed mengen. Voeg 3 ml van het mengsel aan elke acellulaire laag-coating te voegen. Incubeer 45 min bij 37 ° C in een 5% CO 2 weefselkweek incubator. Kleur van het mengsel moet worden van stro geel naar roze. Na de gel stolt, voeg DMEM met 10% FBS (2 ml binnen en 10 ml buiten het invoegen in elke well van de huid te reconstrueren trays). Incubeer voor 4 dagen en zorg ervoor dat de gel contracten. Aspireren medium van zowel binnen als buiten elke insert. Voeg wassen medium (HBSS met 1% gedialyseerd FBS) 2 ml aan de binnenkant en 10 ml aan de buitenkant van de plaatsen om te wassen regelmatig serum. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C. De voorbereiding van de huid te reconstrueren medium: Voor normale melanocyt en dermale stamcel reconstrueert: Om basisch milieu (500 ml), meng de volgende reagentia: 490 ml keratinocyte serum-vrij medium, 1,8 ml runder hypofyse-extract, 10 ml gedialyseerd foetaal runderserum, 500 pl van 10 ug / mL SCF, 562,5 ul van 4 ug / ml bFGF en 500 ul van 264 ug / ml ET-3. Medium I: Voeg 10 pl EGF van 100 ug / ml tot 100 ml elementaire medium. Medium II: Voeg 2 pl EGF tot 100 ml elementaire medium. Medium III: Voeg 720 ul CaCl 2 van 1 M tot 300 ml elementaire medium. Voor melanoom huid te reconstrueren: Om Medium I (100ml), de volgende reagentia mix: 72,5 ml DMEM, 24 ml F12 (HAM's), 2 ml L-glutamine van 200 mm, 200 ul hydrocortison van 269 g / mL, 200 ul VV-regeling van de 500X, 200 ul O-phosphorylethanolamine van 0,05 M, 200 ul adenine van 90 mm, 200 ul Progesteron van 2 nm, 240 pl CaCl 2 van 1 m, 200 pl Triiodothyronine van 10 Nm en 100 ul van chelexed pasgeboren kalf serum (ontbinden 3 g Chelex 100 in 100 ml serum, roer 1,5 uur bij 4 ° C, filter steriliseren). Om ervoor te Medium II (100ml), meng de volgende reagentia: 72,5 ml DMEM, 24 ml F12 (HAM's), 2 ml L-glutamine van 200 mm, 200 ul hydrocortison van 269 g / mL, 200 ul VV van 500X, 200 ul O-phosphorylethanolamine van 0,05 M, 200 ul adenine van 90 mm, 200 ul Progesteron van 2 nm, 240 ul van 1 M CaCl2, 200 ul Triiodothyronine van 10 nm en 100 ul pasgeboren kalf serum. Om ervoor te Medium III (300ml), meng de volgende reagentia: 142,5 ml DMEM, 142,5 ml F12 (HAM's), 6 ml L-glutamine van 200 mm, 600 ul hydrocortison van 269 g / mL, 600 ul VV van 500X , 600 ul O-phosphorylethanolamine van 0,05 M, 600 ul adenine van 90 mm, 600 ul Progesteron van 2 nm, 720 pl CaCl 2 van 1 M, 600 ul Triiodothyronine van 10 Nm en 6 mL pasgeboren kalf serum. Trypsinize humane keratinocyten van cultuur flessen met 0,05% trypsine / EDTA, trypsine met soja-bonen trypsine-remmer (250 mg / L in 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing) te neutraliseren, spin down, resuspendeer een cel pellet op 4,17 x 10 6 cellen / ml in de huid te reconstrueren medium I. Trypsinize menselijke melanocyten of melanoom cellen van cultuur flessen met 0,05% trypsine / EDTA, neutraliseren trypsine met soja-bonen trypsine-remmer, spin down, een celpellet op 0,83 resuspendeer x 10 6 cellen / ml in de huid te reconstrueren medium I. Verwijder het wassen medium van zowel binnen als buiten elke insert. Voeg de huid reconstrueren medium I (1,5 ml aan de binnenkant en 10 ml aan de buitenkant van elke insert). Neem 600 pi celsuspensie van keratinocyten en 600 pi celsuspensie van melanocyten of melanoomcellen, meng goed. Verdeel 200 ul gemengde cel suspensie druppelsgewijs aan de binnenkant van elke insert. Voor de dermale stamcellen te reconstrueren, gebruik 100 ul van keratinocyten opschorting slechts. Incubeer gedurende 2 dagen bij 37 ° C. Aspireren huid te reconstrueren medium Ivan zowel de binnenkant en de buitenkant van elke insert. Voeg de huid reconstrueren medium II (2 ml aan de binnenkant en 10 ml naar buiten). Incubeer nog 2 dagen bij 37 ° C. Aspireren huid te reconstrueren medium II van de binnenkant en de buitenkant van elke insert, voeg 7,5 ml huid medium III reconstrueren om alleen de buitenkant. Vanaf dit punt, het oppervlak van reconstrueert begint wordt blootgesteld aan de lucht. Verandering medium III om de andere dag tot dag 18. Oogst huid te reconstrueren op dag 18: Aspireren media van de binnenkant en de buitenkant van inserts. Verwijder de inzetstukken uit lade met een pincet. Knip de te reconstrueren (inclusief het polycarbonaat filter) door het traceren van een cirkel dicht bij de rand met een scalpel. Snijd de wederopbouw en het filter in de helft op een hard oppervlak. Voor paraffine secties: plaats de helft van de te reconstrueren in een histologie cassette tussen twee zwarte TBS biopsie papieren en genieten van de hele cassette in 10% formaline voor meer dan 4 uur. Plaats vervolgens de cassette in 70% ethanol en op te slaan bij 4 ° C totdat u klaar bent om het te reconstrueren voor paraffine inbedding proces. Voor vriescoupes: Leg de andere helft van de te reconstrueren in 50% saccharose bij 4 ° C gedurende 1-2 uur, verander dan de sucrose te 2M en bij 4 ° C op te slaan voor een ander 1-2 uur. Verdeel een optimale snijden temperatuur het vriespunt media (LGO) in een wegwerp basis mal, zodat het vult ongeveer 50% van de boot. Vermijd luchtbellen in de LGO. Pak de rand van het te reconstrueren met een tang en verwijder de te reconstrueren uit de sucrose. Plaats het op Kimwipes tot de Kimwipes absorberen de sucrose. Breng de te reconstrueren in de basis vorm op de top van de LGO, met behulp van pincet en een spatel. Bedek de bovenkant van het te reconstrueren met meer LGO tot de basis vorm is helemaal vol. Zorg ervoor dat je geen luchtbellen hebben in de LGO waardoor het snijden moeilijk. Gelijkmatig Plaats het basisstation schimmel op gemalen droog ijs, en laat de LGO volledig bevriezen. Wikkel de basis vorm in aluminiumfolie en bij -70 ° C op te slaan totdat u klaar bent om het te snijden met een cryostaat. Graft een skin te reconstrueren op een muis: Bereid een 50 ml Falcon buis met 5 ml DMEM (voor invriezen en ontdooien de huid van muizen). Gebruik een vrouwelijke SCID haarloze outbred muis rond de 6 weken. De muis is verdoofd met isofluraan (EZ anesthesie systeem): de eerste verdoving wordt uitgevoerd in de inductie kamer met 4% isofluraan (voor de muis wordt verplaatst naar de chirurgische bed) en onderhouden van anesthesie door middel van een neuskegel adempauze tijdens de procedure (isofluraan: 1,5-2% ). Warmte ondersteuning door een verwarmde pad om onderkoeling en steriele toegediende oogheelkundige smeermiddel te voorkomen oculaire letsel te voorkomen tijdens de anesthesie. Doe 600 ml water in een beker en laat op de top van een hete plaat om temperatuur van het water te houden tussen 40 – 60 ° C. Reinig de huid van muizen met samengestelde benzoë tinctuur en alcohol prep swabs. Markeer een lijn op de top van de muis terug naar dezelfde positie te houden voor het hechten later. Snijd een ronde wondbed ongeveer 1,2 cm in diameter op de muis bovenrug met behulp van Iris schaar en pincet. Bedek de wond met een steriel gaasje sponzen. Leg de ronde muis huid in 5 ml DMEM, dan laat in vloeibare stikstof container totdat het helemaal bevroren. Ontdooi de buis in heet water op de top van een hete plaat totdat er ontdooid. Herhaal dit 3 keer. Maak de huid te reconstrueren uit de transwell met behulp van chirurgische mes en verwijder het membraan zeer zorgvuldig, overdracht van de huid (epidermis naar boven) te reconstrueren op de top van het wondbed. Plaats de muis huid (epidermis naar boven) op de top van de huid te reconstrueren. Maak de eerste hechting op de marker eerder gemerkt, de tweede op de bodem, daarna nog twee hechtingen aan de zijkanten van de muis huid op te lossen. Reinig de huid van muizen na de transplantatie. Verwijder de neuskegel en houd de muis op het verwarmde pad totdat wakker en ambulante. Zet de muis in een nieuwe kooi. Post-operatieve analgesie: Meloxicam (1 mg / kg) via subcutane injectie onmiddellijk na de operatie, 24 uur en 48 uur na de operatie. 2. Representatieve resultaten: Huid reconstrueert met normale melanocyten en dermale stamcellen De huid reconstrueert worden gekweekt in een speciaal 6-well tray met inserts. De dermale compartiment is gekweekt in DMEM met 10% FBS voor de eerste vier dagen (Fig. 1A). De huid reconstrueren medium I wordt gebruikt wanneer keratinocyten zijn bezaaid met melanocyten of melanoom cellen (Fig. 1B). De epidermis is blootgesteld aan de lucht op dag 9 en dit maakt keratinocyten om onderscheid te maken (Fig. 1C). Op dag 18, de epidermis van de huid reconstrueert is samengesteld uit gelaagd keratinocyten lagen. De ongedifferentieerde basale laag en opeenvolgend gedifferentieerde lagen zijn verticaal georiënteerd (fig. 1D). VlekING het gedeelte van reconstrueert met de melanocytaire marker S100 laat zien dat melanocyten worden uitgelijnd in de basale laag van de opperhuid en te communiceren met meerdere keratinocyten door dendriet extensies (fig. 1E). De dermale compartiment bevat fibroblasten ingebed in een collageen type I matrix. Gedeponeerd collageen IV geeft de basale membraan, die de opperhuid scheidt van de dermis (fig. 1F). Wanneer dermale stamcellen (gelabeld met GFP lentivirale vector) zijn ingebed met fibroblasten in een collageen I matrix, trekken ze naar de epidermis en te differentiëren in melanocyten (1), (afb. 2). Meerdere lagen van keratinocyten in de epidermis worden ontwikkeld. Huid reconstrueert van melanoom tumoren Clinicopathologische studies wijzen uit dat melanomen vooruitgang in een stapsgewijs: gemeenschappelijke verworven naevi, dysplastische nevi, RGP (radiale groeifase) melanomen, VGP (verticale groeifase), melanomen en metastatische melanomen (7). Verschillende stadia van melanoom cellijnen zijn morfologisch op elkaar lijken in 2-D cultuur (Fig. 3A-D), maar wanneer zij worden opgenomen in de huid reconstrueert, het gedrag van de cellen weerspiegelt hun in vivo eigenschappen. De locatie en de groei van normale melanocyten worden streng gecontroleerd in de huid reconstrueert (Afb. 3E). RGP primaire melanomen WM35 prolifereren voornamelijk in de epidermis (fig. 3F), terwijl VGP melanomen WM793 groeien invasief in de dermis (Fig. 3G). Uitgezaaide melanomen 1205Lu agressief diep binnen te dringen in de dermis (Fig. 3H). Figuur 1. Huid reconstrueert met normale melanocyten. De bruto uiterlijk van de huid reconstrueert is te zien in AC. A. Fibroblasten gemengd met collageen worden gekweekt in DMEM met 10% FBS en vorm dermale compartiment. B. keratinocyten en melanocyten worden gezaaid op de top van de dermis en groeien in de huid te reconstrueren medium. C. De epidermis wordt blootgesteld aan de lucht op dag 9. D. H & E-gekleurde huid te reconstrueren presenteert de opperhuid bestaat uit verticaal, gericht op basale laag, en achtereenvolgens gedifferentieerde gestratificeerde cellagen. De dermis bevat fibroblasten ingebed in een collageen type I matrix. E. S100-positieve melanocyten (zwarte pijlen) zijn uitgelijnd op de basaalmembraan en te communiceren met meerdere keratinocyten. F. collageen IV-kleuring geeft aan dat de basale membraan, die de opperhuid scheidt van de dermis. Alle kleuringen in DF werden uitgevoerd op in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde coupes. Figuur 2. Dermal stamcellen in de huid reconstrueert migreren naar de epidermis en differentiëren in melanocyten. Op dag 5 na het uitzaaien keratinocyten, single GFP-positieve cellen (groen) start migreren uit van sferen. De epidermis is nog steeds bestaat uit een enkele laag. Op dag 8, een enkele cellen bij de epidermis-dermis interface. Per dag 10, zijn GFP-positieve cellen strak uitgelijnd op de basale membraan positie. De gemigreerde GFP-positieve cellen in de opperhuid uitdrukkelijke melanocytaire marker HMB45 (rood, zoals aangegeven door witte pijlen). Kernen zijn gekleurd met DAPI (blauw). De epidermis is ontwikkeld als meerdere lagen. De kelder membraan wordt aangegeven met witte stippellijnen. Figuur 3. Huid reconstrueert van de verschillende stadia van melanomen: AD. Normale melanocyten en melanoom cellen gekweekt in 2D culturen. A. Melanocyten van de voorhuid. B. RGP WM35 cellen. C. VGP WM793 cellen. D. uitgezaaide melanomen 1205Lu cellen. E. Normale melanocyten bevinden zich op de basale membraan. F. RGP melanoom WM35 cellen groeien als cel clusters in de opperhuid. G. VGP melanoom WM793 cellen binnen te dringen in de dermis door basaal membraan. H. uitgezaaide melanoom 1205Lu cellen binnen te dringen agressief diep in dermis. Het oplossen van problemen Probleem Het oplossen van problemen Collageen mengsel niet stollen Collageen mengsel kleur moet worden stro-geel naar roze, anders pH-waarde is verkeerd en collageen kan niet gel. Als de kleur is helder geel, moet meer natriumbicarbonaat worden toegevoegd druppelsgewijs. Collageen precipitaten voortijdig in de mixuture Houd alle componenten op ijs totdat het collageen mengsel wordt geplaatst op de plaats Gecontracteerd collageen is niet eens (de ene kant is dikker dan de andere kant) Kalibreer de plank van de incubator De opperhuid wordt gevormd met minder dan drie lagen keratinocyten. Gebruik ongedifferentieerde keratinocyten bij lagere passages