الجلد ثلاثي الأبعاد إعادة بناء الإنسان النموذجي : أداة لدراسة بشرة العادية والتقدم الميلانوما
Summary
في هذا التقرير ، إلا أننا تصف البشرة ثلاثي الأبعاد إعادة بناء النموذج الذي يحاكي الجلد البشري في مجال العمارة وتكوينها. وقد تم التحقيق في فسيولوجيا الخلايا الصباغية ، تطور سرطان الجلد ومصير الخلايا الجذعية عن طريق الجلد باستخدام نموذج إعادة بناء الجلد. هذا النموذج هو مفيد أيضا كأداة لتقييم ما قبل السريرية على المخدرات.
Abstract
وقد تم القيام به في معظم الدراسات المختبرية في مجال البيولوجيا التجريبية في الجلد 2 الزراعات الأحادية الأبعاد (2D) ، في حين أن الأدلة تشير إلى أن تراكم الخلايا تتصرف بشكل مختلف عندما يتم تربيتها داخل المصفوفة خارج الخلوي 3D ، وكذلك تتفاعل مع الخلايا الأخرى (1-5) . وقد تم استخدام نماذج الماوس على نطاق واسع لدراسة التشكل الأنسجة في الجسم الحي. لكن الماوس وجلد الإنسان واختلافات كبيرة في مجال العمارة والفيزيولوجيا الخلوية ، مما يجعل من الصعب استقراء دراسات الماوس إلى البشر. لأن معظمها مترجمة الخلايا الصباغية في الجلد الماوس في بصيلات الشعر ، لديهم الخصائص البيولوجية تختلف عن تلك التي للبشر ، والذي حدد في المقام الأول الطبقة القاعدية من البشرة. التطورات الأخيرة في جلد الإنسان 3D إعادة نماذج مكن هذا المجال لتحقيق مصفوفة الخلايا والخلايا خلايا التفاعلات بين أنواع مختلفة من الخلايا. ويعيد تتكون من "الأدمة" مع الليفية مضمن في مصفوفة أنا الكولاجين ، وهو "البشرة" ، التي تتألف من الخلايا القرنية ، طبقية متمايزة والغشاء القاعدي وظيفية ، والذي يفصل بين البشرة من الأدمة. الكولاجين ويوفر السقالات وإيصال المواد الغذائية ، وإمكانية الخلية الى خلية التفاعل. نماذج دمج خلايا الجلد الصباغية 3D ألخص ملامح التوازن الطبيعي للخلايا الصباغية وتطور سرطان الجلد في جلد الإنسان. كما هو الحال في الجسم الحي ، والمترجمة الخلايا الصباغية في الجلد بناؤها في الغشاء القاعدي تتخللها الكيراتينية الطبقة القاعدية. خلايا سرطان الجلد يحمل نفس الخصائص التي تعكس مرحلة الورم الأصلي (RGP ، VGP وخلايا سرطان الجلد المنتشر) في الجسم الحي. مؤخرا ، تم التعرف على الخلايا الجذعية في الجلد والأدمة الإنسان (6). يمكن لهذه الخلايا الجذعية متعددة قوية الهجرة إلى البشرة وتفرق إلى الخلايا الصباغية.
Protocol
Discussion
وقد وصفت لنا توليد 3D يعيد الجلد الصباغية مع الإنسان العادي ، والخلايا الجذعية خلايا الجلد وسرطان الجلد. عندما نمت في الثقافة أحادي الطبقة ، والخلايا الصباغية تقديم التشكل مماثلة (سويت بالارض والمغزل أو أكثر على شكل شجيري) بغض النظر عن أصلهم من المرحلة السريرية. في المقابل ، يعيد الجلد 3D ألخص مرحلة معينة من خصائص خلايا سرطان الجلد. الصباغية الإنسان العادي يقيم في الطابق السفلي الأغشية بين البشرة وطبقات الجلد والخلايا واحدة. خلايا سرطان الجلد RGP الابتدائية تنمو في شكل مجموعات صغيرة على طول الغشاء القاعدي في حين أن خلايا سرطان الجلد أكثر عدوانية VGP تنمو كتل كبيرة اختراق الغشاء القاعدي في الأدمة. تنمو خلايا سرطان الجلد المنتشر في كل الاتجاهات وغزو عميقا في الأدمة كخلايا مفردة أو مجموعات. يمكن إجراء التحليلات الكمية على هذا النموذج من خلال قياس عمق غزو ومدى الانتشار. بالإضافة إلى توصيف الخلايا الصباغية العادية والخبيثة ، وذلك باستخدام نموذج يمكن أن تحفز مباشرة تمايز الخلايا الجذعية إلى الخلايا الصباغية الجلدي نضجت ، والتي تضم الطبقة القاعدية من البشرة وإقامة الاتصالات مع حسن النية من خلال القرنية upregulation من E – كادهيرين ( 6).
باستخدام ناقلات فيروسية ، ونحن قادرون على تفعيل أو تعطيل وظيفة الجين لفهم أفضل للديناميات وأهميتها الوظيفية من الجينات التي أعرب عنها كل نوع من الخلايا في الجلد يعيد ، والتي تبشر بأن تكون نموذجا فعالا لدراسة آليات التحول ليس فقط من الخلايا الصباغية ، ولكن أيضا تطور سرطان الجلد (8). أصبح على المدى الطويل مراقبة الظواهر الخلية ممكن من خلال ترقيع الجلد يعيد العوز المناعي للحيوانات. مثل هذا الإنسان جلد الفأر الوهم هو أداة ممتازة لدراسة البحوث melanomagenesis والانبثاث سرطان الجلد.
يعيد الجلد يمكن أيضا أن تكون منبرا مفيدا لتقييم المخدرات. العديد من الأدوية التي قضاء على الخلايا السرطانية في ظروف ثقافة 2D غالبا ما يكون تأثير يذكر في مجال التطبيقات التجريبية والسريرية. كما رأينا في الورم في الجسم الحي ، وخلايا سرطان الجلد في الثقافات 3D غالبا ما تكون مقاومة للعقاقير التي الخلايا في الاستجابة للثقافات 2D ، مما يوحي بأن المكروية ينظم مسارات إشارات في سرطان الجلد. لاكتشاف المخدرات ناجحة ، والجلد 3D إعادة بناء النموذج هو أداة مثالية قبل السريرية على التنبؤ بآثار المركبات في فيفو (9،10).
باختصار ، إعادة بناء نماذج الجلد جسر الفجوة بين في التجارب المختبرية والدراسات المجراة. سوف يؤدي إلى فهم أفضل لجينات التي تشارك في عملية التحول ، وكيف الخلايا الجذعية تسهم في هذا التحول.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الحيوان معهد ويستار مرفق ، ومرفق المجهري ، ومرفق Histotechnology ومركز الأبحاث التموين. وقد تم تمويل هذه الدراسة في جزء من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة CA 076674 ، CA 098101 ، 025874 و CA CA 10815.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| 10x EMEM | Bio Whittaker | 12-684F |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH-30071.02 |
| Bovine Tendon Acid-Extracted Collagen | Organogenesis | 200/50 |
| Tissue Culture 6-well Trays with Inserts | Organogenesis | 9285 |
| Keratinocyte Serum Free Medium | Gibco | 17005042 |
| Dialyzed Fetal Calf Serum | Hyclone | SH-30079.03 |
| recombinant Human Stem Cell Factor | Fitzgerald Industries | RDI-307-255X |
| Basic FGF | Fitzgerald Industries | 30R-AF015 |
| Endothelin-3, human | American Peptide Co. | 88-5-10 |
| Calcium Chloride | Sigma | C-7902 |
| DMEM | JRH biosciences | 56430-10L |
| F12 (HAM’s) | Gibco | 11765-54 |
| Hydrocortisone | Sigma | H-0888 |
| Insulin, Transferrin, Ethanolamine, Selenium (ITES) | BioWhittaker | 17839Z |
| O-Phosphorylethanolamine | Sigma | P0503 |
| Adenine | Sigma | A9795 |
| Progesterone | Sigma | P-8783 |
| Triiodothyronine | Sigma | T-5516 |
| Newborn calf serum | Hyclone | SH3011802 |
| 10% buffer formalin | Surgipath | 00600 |
| Optimal cutting temperature freezing media (OCT) | Sakura | 4583 |
| Multi cassettes | Surgipath | 02293-BX |
| TBS biopsy papers | Triangle Biomedical Sciences | BP-B |
| TBS biopsy papers | Triangle Biomedical Sciences | BP-B |
| Disposable Base Molds | Fisher | 15-182-501C |
| Compound benzoin tincture | Professional Disposables, Inc, | S42450 |
| Alcohol Prep Swabs | CVS pharmacy | |
| Silk Black Braided 5-0 | Ethicon | 682G |
| Gauze sponges (sterile) | CVS pharmacy | |
| Forceps | Roboz | RS5070 |
| Iris scissors | Roboz | RS5913 |
| Surgical blades | Feather | 2976 |
| EZ anesthesia | Euthanex Corp. | |
| SCID hairless outbred mouse | Charles river |
References
- Sun, T., Jackson, S., Haycock, J. W., MacNeil, S. Culture of skin cells in 3D rather than 2D improves their ability to survive exposure to cytotoxic agents. J Biotechnol. 122, 372-381 (2006).
- Smalley, K. S., Lioni, M., Herlyn, M. Life isn’t flat: taking cancer biology to the next dimension. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 42, 242-247 (2006).
- Sun, T., Norton, D., McKean, R. J., Haycock, J. W., Ryan, A. J., MacNeil, S. Development of a 3D cell culture system for investigating cell interactions with electrospun fibers. Biotechnol Bioeng. 97, 1318-1328 (2007).
- Kremer, M., Lang, E., Berger, A. Organotypical engineering of differentiated composite-skin equivalents of human keratinocytes in a collagen-GAG matrix (INTEGRA Artificial Skin) in a perfusion culture system. Langenbecks Arch Surg. 386, 357-363 (2001).
- Escámez, M. J., Garcí, M., Larcher, F., Meana, A., Muñoz, E., Jorcano, J. L., Del Río, M. An in vivo model of wound healing in genetically modified skin-humanized mice. J Invest Dermatol. 123, 1182-1191 (2004).
- Li, L., Fukunaga-Kalabis, M., Yu, H., Xu, X., Kong, J., Lee, J. T., Herlyn, M. Human dermal stem cells differentiate into functional epidermal melanocytes. J Cell Sci. 123, 853-860 (2010).
- Meier, F., Nesbit, M., Hsu, M. Y., Martin, B., Van Belle, P., Elder, D. E., Schaumburg-Lever, G., Garbe, C., Walz, T. M., Donatien, P., Crombleholme, T. M., Herlyn, M. Human melanoma progression in skin reconstructs: biological significance of bFGF. Am J Pathol. 156, 193-200 (2000).
- Yu, H., McDaid, R., Lee, J., Li, L., Kumar, S. M., Elder, D. E., Van Belle, P., Gimotty, P., Guerra, M., Hammond, R., Nathanson, K. L., Dalla Palma, M., Herlyn, M., Xu, X. The role of BRAF mutation and p53 inactivation during transformation of a subpopulation of primary human melanocytes. Am J Pathol. 174, 2367-2377 (2009).
- Lee, J. T., Li, L., Brafford, P. A., van den Eijnden, M., Halloran, M. B., Sproesser, K., Haass, N. K., Smalley, K. S., Tsai, J., Bollag, G., Herlyn, M. PLX4032, a potent inhibitor of the B-Raf V600E oncogene, selectively inhibits V600E-positive melanomas. Pigment Cell Melanoma Res. 23, 820-827 (2010).
- Tsai, J., Lee, J. T., Wang, W., Zhang, J., Cho, H., Mamo, S., Bremer, R., Gillette, S., Kong, J., Haass, N. K. Discovery of a selective inhibitor of oncogenic B-Raf kinase with potent antimelanoma activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 3041-3046 (2008).
