Fabricatie van elektrochemische-DNA Biosensoren voor de Reagentless detectie van nucleïnezuren, eiwitten en kleine moleculen

1. Instellen van de Stage De aankoop van de relevante, chemisch gemodificeerd probe DNA van een aangepaste oligonucleotidesynthese bedrijf, zoals Biosearch Technologies (Novato, CA) of Midland Certified (Midland, TX). De sonde wordt gewijzigd tijdens de synthese door de toevoeging van een C6-thiol in zijn 3'-uiteinde en een redox-actieve methyleenblauw op zijn 5'-uiteinde. Los van de probe-DNA in fosfaat gebufferde zoutoplossing pH 7,4 tot een concentratie van 200 uM en controleer de concentratie door het meten van de absorptie ervan bij 260 nm met behulp van een spectrofotometer. Door de methyleenblauw-groep op de DNA-probe de oplossing moet een zichtbare blauwe tint. Vers voor te bereiden 1 ml van een 10 mM oplossing van tris (2-carboxyethyl) fosfine TCEP in gedestilleerd, gedemineraliseerd water (DI-water). In onze ervaring, deze TCEP oplossingen nog vers voor een week wanneer ze worden bewaard in het donker bij 4 ° C. Ter beperking van eventuele disulfide bindingen die aanwezig kunnen zijn in de probe DNA-oplossing, combineren een pi van de probe DNA stockoplossing met 2 pl van de TCEP oplossing en meng voorzichtig met een pipet. Incubeer dit mengsel gedurende een uur in een donkere, gekoelde container. De aanvankelijk blauwe oplossing moet duidelijk worden als de TCEP reversibel vermindert de methyleenblauw. Als de oplossing niet duidelijk geworden, herhaal dan de procedure met behulp van een verse TCEP oplossing of, eventueel, bij kamertemperatuur. Na een uur verdunnen de verminderde DNA-probe-oplossing met 1 ml buffer, dit zal het verdunnen tot een concentratie van 200 Nm. Later zul je incuberen een set gouden schijf elektroden in 200 pi gedeelten van deze verdunde oplossing probe. Vers voor te bereiden ten minste 2 ml van 2mm mercaptohexanol in fosfaat gebufferde zoutoplossing. 2. Sensor Voorbereiding Combineer 0,05 micron alumina poeder met water op een fijne poetsdoek. Poolse een reeks van gouden schijf elektroden (CH Instruments, Austin, TX) door te drukken op het goud oppervlak stevig in de natte doek, en bewegen ze in een cijfer acht patroon voor ongeveer drie minuten per elektrode. Spoel de gepolijste elektroden met DI-water en dompel ze in Eppendorf buisjes gevuld met dezelfde. Sonificeer vijf minuten om eventuele resterende alumina poeder te verwijderen. Plaats de elektroden in een 0,5 M zwavelzuur oplossing, plak ze op een potentiostaat samen met een platina teller en zilver / zilverchloride referentie-elektrode, en uitvoeren van een reeks van voltammogrammen te oxideren, te verminderen, en elektrochemisch reinigen hun oppervlakken. Naar aanleiding van dit uitvoeren van een seconde elektrochemische schoonmaken in een oplossing van 0,01 M KCl in 0,1 M zwavelzuur. De fijne details van deze reiniging procedures vindt u in onze Nature protocollen papier 1, en ​​in de aanvulling op deze video. Schik een set van 2 ml Eppendorf buizen in een rek en vul elk met 200 pi van de probe DNA-oplossing. De concentratie van de probe DNA in deze oplossing zal bepalen de dichtheid waarmee de sonde DNA's pack op de sensor oppervlak. Prestaties van de sensor is sterk afhankelijk van de sonde dichtheid, met de optimale dichtheid variërend van een sensor de architectuur naar de volgende. De probe concentratie gebruikt bij deze stap moet dus worden geoptimaliseerd voor elk nieuw type sensor 2. Voor de sonde architecturen we hebben onderzocht tot op heden, de sonde DNA-concentraties die we gebruiken in deze stap variëren van 15 nM tot 2 micrometer, met 200 nM als een typische waarde. Spoel de gouden schijf elektroden met DI-water, en ze vervolgens onder te dompelen in de desbetreffende probe-DNA-oplossing in een Eppendorf buis voor een uur. Op dit punt, zal de sonde DNA hechten aan de gouden elektrode-oppervlak via de vorming van een thiol-on-goud zelf geassembleerde monolaag. Spoel de elektroden met DI-water, dompel hen in 2 mM mercaptohexanol in een Eppendorf buis en bewaar deze op een donkere plaats voor 3 uur 's nachts bij kamertemperatuur te voltooien de vorming van het zelf geassembleerde monolaag te verzekeren. Deze stap omvat het mercaptohexanol als onderdeel van een gemengde monolaag te zorgen voor de vorming van een stabiele monolaag. Om te voorkomen dat verdamping wilt u misschien de elektrode afdichting in de eppendorfbuisje met parafilm. Sensoren kunnen worden opgeslagen in deze oplossing voor enkele dagen als dat nodig is. Wanneer u klaar bent om de sensor te gebruiken, spoel het met DI-water en dan laten weken in een buffer voor ten minste tien minuten. Sensoren die gericht zijn op opsporing van antilichamen moet ook worden ondergedompeld in een 100 nM oplossing van de relevante erkenning streng voorafgaand aan het gebruik, gevolgd door een uiterst snelle spoelen met buffer. 3. Sensor testen, DNA-detectie In dit protocol, is een 17 nucleotide sonde draad aangebracht op een gouden elektrode. Het heeft een methyleenblauw redox reporter op zijn 3'-uiteinde (figuur 1). Wanneer de probe molecuul hybridiseert met een capture streng, de stroom door de sensor circuit af. Spoel een frisse sensor met DI-water en dompel het in een legemonster ontbreekt het doel om op de achtergrond signaal dat produceert op te nemen. Bevestig de sensor op de werkende elektrode leiding van een potentiostaat. Plaats een platina elektrode en een zilver / zilverchloride referentie-elektrode in de oplossing. Voer een blokgolf meting 0 tot -0,6 V met een amplitude van 25 mV en een stapgrootte van 1mV. De optimale blokgolf frequentie zal afhangen van de details van de sonde architectuur 2,3, want de sonde architecturen hebben we in dienst van de optimale waarden zijn meestal in tussen 60 en 600 Hz. Ziet u een ronde piek op ongeveer -0,35 V, de redoxpotentiaal van methyleenblauw (de piek potentieel kan enigszins verschuiven afhankelijk van de precieze pH-waarde van uw test-oplossing). De hoogte van de baseline huidige naar deze piek is evenredig met de efficiëntie elektron overdracht tussen de methyleenblauw en de goud-elektrode (Figuur 2). Bewaar deze achtergrond meting. Verplaats de elektroden naar een oplossing die het doelwit DNA-molecuul van belang bevat, evenwicht (5 tot 120 min, afhankelijk van de omvang, structuur en concentratie van de target4, 5) en het verzamelen van een seconde blokgolf voltammagram. De hoogte van de piek bij -0,35 V zal veranderen van de eerste, achtergrond meting. De omvang van deze verandering is gerelateerd aan de concentratie van de analyt. Het is de belangrijkste output gegevens van deze sensor (figuur 3). Het meten van relatieve signaal te veranderen, de procentuele daling of stijging van het signaal ten opzichte van de achtergrond piek, is vaak beter reproduceerbaar dan het meten van de absolute verandering in de huidige, omdat deze corrigeert voor verschillen in de oppervlakte van de elektrode. Om dit te doen, zijn het verschil tussen de piekstroom en de achtergrond piekstroom gedeeld door de achtergrond piekstroom. 4. Sensor Regeneratie Zodra uw metingen zijn voltooid, verplaatst u de sensor in een bak met DI-water gedurende 30 s, of spuit met een gestage stroom van DI-water gedurende 30 s. Herhaal dit nog twee keer met vers gedeïoniseerd water. Let op: sommige analyten zijn resistent tegen deze aanpak, want ze uit te proberen agressieve spoelen in 6 M guanidine hydrochloride of 70% ethanol. Plaats de sensor in een oplossing waarbij de metingen zullen worden gedaan. Binnen een minuut moet de piekhoogte zijn teruggekeerd naar de oorspronkelijke waarde. Het is vermeldenswaard dat deze sensoren vaak een iets groter signaal veranderen tijdens hun eerste test en regeneratie-cyclus, en zeer consistente resultaten tijdens de volgende cycli 6 vertonen. 5. Sensor testen, opsporing van antilichamen In dit protocol, de methyleen-blauw en thiol-gemodificeerde DNA probe gebruikt in deze sensoren dient als een 'anker' streng 7. Het is direct verbonden met de gouden elektrode. Dit wordt vervolgens gehybridiseerd met een tweede, "erkenning" DNA streng die is covalent geconjugeerd aan het relevante antigeen (figuur 4). We hebben veel geluk met commerciële synthese huizen, zoals Biosearch Technologies en Panagene, voor de synthese van de benodigde DNA-antigen hersenschimmen. De hybridisatie stap wordt uitgevoerd door de overdracht van een prefab-sensor in een Eppendorf buisje met 100 nM van de relevante erkenning DNA-streng in PBS gedurende 1 uur. Plaats de sensor in de desbetreffende blanco-oplossing. Bevestig het aan de werkende elektrode leiding van een potentiostaat en plaats een platina elektrode en zilver / zilverchloride referentie-elektrode in de oplossing. Voer blokgolf voltammetrie zoals hierboven beschreven. Voor de specifieke probe architectuur hebben we hier in dienst van de optimale blokgolf frequentie is 60 Hz. Ziet u een afgeronde piek rond -0,35 V. Bewaar deze achtergrond meting. Breng de elektroden aan een oplossing die de doelanalyt, incubeer gedurende 5 tot 60 minuten, en het verzamelen van een seconde blokgolf voltammagram. Als het doel antilichaam aanwezig is de piek bij -0,35 V zal afnemen. De omvang van deze verandering is gerelateerd aan het antilichaam concentratie. 6. Sensor Testen, Small Molecule Detectie In dit geval, de sonde molecuul op de sensor oppervlak is een aptameer, een DNA-of RNA-molecuul dat is geselecteerd in vitro aan een specifieke moleculaire analyt, dat de structuur verandert (vouwen) binden na binding aan de doelanalyt 8,9 ( figuur 5). Hier hebben we gebruik van een cocaïne-bindend, DNA aptameer ontwikkeld door de Stojanovic 10,11 lab. Spoel een frisse sensor met DI-water en dompel het in een blanco monster ontbreekt het doel om op de achtergrond signaal dat produceert op te nemen. Bevestig de sensor op de werkende elektrode leiding van een potentiostaat. Plaats een platina teller en een zilver / zilverchloride referentie in de oplossing. Voer blokgolf voltammetrie zoals hierboven beschreven. Voor de specifieke probe architectuur die we hier hebben in dienst van de optimale blokgolf frequentie is 200 Hz (Maar 60 Hz werkt ook). Ziet u een afgeronde piek rond -0,35 V. Bewaar deze achtergrond meting. Breng de elektroden aan een oplossing die de doelanalyt, incuberen tot ~ 5 min, en het verzamelen van een seconde blokgolf voltammagram. De hoogte van de piek bij -0,35 V zal veranderen. De omvang van deze verandering is gerelateerd aan de concentratie van de doelanalyt. Als je niet kunt verkrijgen van een cocaïne-monster, procaine, waarvan het gebruik is niet-gereguleerde, kan gebruikt worden als een vervanger. 7. Representatieve resultaten: Wanneer gebruikt om DNA te detecteren met behulp van de eerste architectuur, moet het signaal daling met minstens 60% bij het evenwicht bij 200 nM doel. Na drie korte spoelt in gedeïoniseerd water, moet het signaal terug te keren heel dicht (binnen 0,1 tot 5%) tot de oorspronkelijke waarde. Opsporing van antilichamen sensoren moeten volgens een signaal daling van 40 tot 80%. Aptameer-gebaseerde sensoren voor de detectie van cocaïne vertonen een signaal kan oplopen tot 200% afhankelijk van de frequentie en de bedekking van het oppervlak waarop zij opereren. Voor de cocaïne-sensor, een lage bedekking van het oppervlak is het beste 3. Figuur 1. Detectie van DNA met een elektrochemische DNA biosensor. Figuur 2. Screen shot toont het signaal geproduceerd door een E-DNA biosensor tijdens blokgolf voltammetrie. Figuur 3. Schermafbeelding zien de signalen die door een E-DNA biosensor tijdens vierkante golf voltammetrie, voor en na hybridisatie met een analyt. Figuur 4. Detectie van antilichamen met een steiger biosensor. Figuur 5. Detectie van cocaïne of procaïne met een elektrochemische aptameer biosensor. Op maat Oligo Volgorde Reacties Lineaire Probe DNA (LP17) 5'-HS-(CH2) 6-TGGATCGGCGTTTTATT-(CH2) 7-NH-MB-3 ' HPLC Gezuiverd, kan worden besteld met de SS Doelanalyt DNA AATAAAACGCCGATCCA Ongewijzigd Erkenning Strand 5'-Antigen-TEG-CAGTGGCGTTTTATTCTTGTTACTG-3 ' Steiger Anker 5'-HS-(CH 2) 6-GCAGTAACAAGAATAAAACGC CACTGC-(CH 2) 7-MB HPLC Gezuiverd, kan worden besteld met de SS A4 Cocaïne aptameer 5'-HS-AGACAAGGAAAATCCTTCAATGAAGTGGGTCG-MethyleneBlue-3 ' HPLC Gezuiverd, kan worden besteld met de SS Tabel 1. Sonde en Target DNA-sequenties.