Summary

Vero細胞培養アッセイによるフィールドコレクト蚊から感染性ウイルスの検出

Published: June 09, 2011
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Summary

我々はプロセスに方法を記述し、画面のヴェロ細胞培養アッセイによりウイルスの多様性のための蚊をフィールド集めた。この手法を採用することにより、我々はコネチカットで収集された蚊の4分類の家族から9種類のウイルスを検出した。

Abstract

蚊は、西ナイルウイルス、デング熱ウイルス、およびchickungunyaウイルスとして重要なヒト病原体などの異なるウイルスの数を送信する。これらのウイルスの多くは彼らの流行の範囲で激化し、新しい地域に拡大し、これらの脅威に対応するための効果的な監視と制御プログラムを必要としている。ウイルスの活動を監視する一つの戦略は、流行のサイトから蚊が大量に収集し、ウイルス感染のためにそれらをテストして。この記事では、我々は、プロセスを処理する方法について説明し、画面のヴェロ細胞培養アッセイにより感染性ウイルスのための蚊をフィールド集めた。蚊は、トラップの位置や種によって並べ替え、および≤50人を含むプールにグループ化されます。プールされた標本は、ミキサー、ミルと水相がコンフルエントVero細胞培養(クローンE6)に接種している使用して緩衝生理食塩水でホモジナイズされています。細胞培養は、日3月7日、接種後から細胞変性効果のために監視され、細胞培養で増殖したウイルスは、適切な診断アッセイによって識別されます。このアプローチを利用することにより、我々はコネチカット、米国で収集された蚊から9種類のウイルスを分離しており、これらのうち、5はヒトの疾患を引き起こすことが知られている。これらのウイルスのうち3つは(ウエストナイルウイルス、ポトシウイルス、そしてラクロスウイルス)北米または1999年以来、ニューイングランド地方のための新しいレコードを表します。ウイルスの広い多様性を検出する能力は、蚊の人口に設立され、新たに出現したウイルスの両方を監視することが重要です。

Protocol

1。蚊のソートと同定次の手順は、ライブ蚊で動作するように訓練されているスタッフが、専用のバイオセーフティレベル2(BSL – 2)実験室でのオープンラボのベンチ上で実行されます。 "コールドチェーン"は、プロシージャ全体で維持されます。 5分間-20℃の冷凍庫で蚊コレクションのバッグを置くことで成虫に住んで麻酔。ドライアイスを含む断熱容器に回収袋を転?…

Discussion

ベロ細胞培養アッセイは、ウイルスの多様性のためのスクリーンのフィールドに収集蚊に効果的な方法として機能します。これは、特にいずれか興味のあるいくつかのウイルスを標的分子の方法とは対照的です。また、我々は、ヴェロ細胞培養アッセイが均等にRT – PCR 7より多くの敏感な場合ではないと今後の研究のために私達の参照のコレクションに格納されているウイルス分離株?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

我々は感謝して博士の重要な貢献を認識する。ジョンアンダーソン、アンドリューメインと本研究へのシャーリーティレル。この作業は、疾病管理予防(U50/CCU116806-01-1)と米国農務省(58-6615-1-218、CONH00768、およびCONH00773)センターからの補助金によって部分的にサポートされていました。

Materials

Name of reagent/ equipment Company Catalog Number
Fetal bovine serum Gibco – Invitrogen 16140
Anti-biotic/mycotic Gibco – Invitrogen 15240
Sodium bicarbonate NaHCO3, 7.5% Soln. Gibco – Invitrogen 25080
L-Glutamine 200mM 100x Gibco-Invitrogen 25030
Powdered minimal essential medium (MEM) Gibco – Invitrogen 11700
10X Dulbecco’s PBS Gibco – Invitrogen 14080
Trypsin-EDTA Gibco – Invitrogen 15400
Rabbit serum Gibco – Invitrogen 16120
Vero Cells (Clone E6) ATCC CRL-1586
Small tissue culture flasks, vented caps, 25 cm2 Falcon – Becton Dickinson 353112
Large tissue culture flasks, vented caps, 175 cm2 Falcon – Becton Dickinson 353108
Copper-coated BB’s, 4.5 mm Crosman 0767
Mixer Mill Retsch MM300
Isopack freezer racks Eppendorf 022510240

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Cite This Article
Armstrong, P. M., Andreadis, T. G., Finan, S. L., Shepard, J. J., Thomas, M. C. Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay. J. Vis. Exp. (52), e2889, doi:10.3791/2889 (2011).

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