Проточной цитометрии анализа иммунных клеток мышей В аорты
Summary
Эта статья представляет проточная цитометрия основе метод для исследования иммунного состав аорты. Документ также показывает дополнительную технику, которая позволяет изучения окружающих и адвентиции стенки сосуда отдельно. Этот метод открывает возможности для выполнения фенотипических анализов аорты лейкоцитов и применить несколько иммунологических анализов для исследования атеросклероза.
Abstract
Атеросклероз является хроническим воспалительным процессом среднего и большого размера судов, которое характеризуется образованием бляшки, состоящие из пены клетки, клетки иммунной системы, сосудистых эндотелиальных и гладкомышечных клеток, тромбоцитов, внеклеточного матрикса и богатых липидами ядро с обширным некрозом и фиброз окружающих тканей. 1 врожденного и адаптивного руки иммунном ответе принимают участие в инициировании, разработке и настойчивость атеросклероза. 2, 3 Существует значительное количество доказательств того, что различные подмножества иммунных клеток, таких как макрофаги, дендритные клетки, Т-и В-лимфоцитов, присутствуют в пределах здоровых аорты и атеросклероз подверженных мышей 4. Кроме того, клетки иммунной системы находятся в окружающем аорты адвентиции что предполагает важную роль этой ткани в атерогенеза 2.
В течение некоторого времени, количественного определения различных типов иммунных клеток, их статус активации и клеточного состава в стенке аорты была ограничена RT-PCR и иммуногистохимических методов исследования атеросклероза. Мало были предприняты попытки выполнить проточной цитометрии с использованием человеческой аорты, а также ряд проблем, таких как высокая аутофлюоресценция, были зарегистрированы 5,6. Человек атеросклеротических бляшек переваривали коллагеназы 1, а свободные ячейки были собраны и окрашены для CD14 + / + CD11c выделить макрофагами клеток, полученных из пены. В этом исследовании, "ложный" канал используется, чтобы избежать ложноположительных окрашиванию. 6 некротические материалов накапливается в процессе пищеварения приводят в большое количество мусора, который генерирует высокий аутофлюоресценция в аорте образцов. Чтобы решить эту проблему, группа отрицательный и положительный контроли была предложена, но только двойного окрашивания могут быть применены в этих образцах. Мы разработали новый проточной цитометрии Метод, основанный 7 для анализа иммунных клеточного состава и характеризуют активации, пролиферации, дифференцировки клеток иммунной системы у здоровых и атеросклероза подверженных аорты. Этот метод позволяет исследовать иммунную состав ячейки стенки аорты и открывает возможности использования широкого спектра иммунологические методы исследования иммунной аспекты этого заболевания.
Protocol
Discussion
Здесь мы представляем потока цитометрии Метод, основанный на исследовании иммунного клеточного состава мышиных аорты. Основным преимуществом этого метода является способность анализировать аорты иммунных клеток на одном уровне клеток и, чтобы охарактеризовать состояние активации ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа выполнена при поддержке Национального института здоровья гранта: PO1 HL55798 (в КЛ) и Американской кардиологической ассоциации ученых грантов на цели развития 0525532U (Е. Г.).
Materials
| Material | Catalog Number | Company |
| Collagenase XI | C7657 | Sigma-Aldrich |
| Hyaluronidase | H3506 | Sigma-Aldrich |
| DNase I, type 2 | D4527 | Sigma-Aldrich |
| Collagenase I | C0130 | Sigma-Aldrich |
| Collagenase II | LS004174 | Worthington Biochemical Corporation |
| Elastase | LS002292 | Worthington Biochemical Corporation |
References
- Lusis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407, 233-2341 (2000).
- Galkina, E., Ley, K. Immune and inflammatory mechanisms of atherosclerosis. Annu Rev Immunol. 27, 165-197 (2009).
- Hansson, G. K., Libby, P. The immune response in atherosclerosis: a double-edged sword. Nat Rev Immunol. 6, 508-519 (2006).
- Galkina, E., Ley, K. Leukocyte influx in atherosclerosis. Curr Drug Targets. 812, 1239-1248 (2007).
- Bonanno, E., Mauriello, A., Partenzi, A., Anemona, L., Spagnoli, L. G. Flow cytometry analysis of atherosclerotic plaque cells from human carotids: a validation study. Cytometry. 39, 158-165 (2000).
- Liu-Wu, Y., Svenningsson, A., Stemme, S., Holm, J., Wiklund, O. Identification and analysis of macrophage-derived foam cells from human atherosclerotic lesions by using a “mock” FL3 channel in flow cytometry. Cytometry. 29, 155-164 (1997).
- Galkina, E., Kadl, A., Sanders, J., Varughese, D., Sarembock, I. J., Ley, K. Lymphocyte recruitment into the aortic wall before and during development of atherosclerosis is partially L-selectin dependent. J Exp Med. 203, 1273-1282 (2006).
- Tung, J. W., Parks, D. R., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Herzenberg, L. A. New approaches to fluorescence compensation and visualization of FACS data. Clin Immunol. 110, 277-283 (2004).
- Smith, E., Prasad, K. M., Butcher, M. Blockade of interleukin-17A results in reduced atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice. Circulation. 121, 1746-1755 (2010).
- Eid, R. E., Rao, D. A., Zhou, J. Interleukin-17 and interferon-gamma are produced concomitantly by human coronary artery-infiltrating T cells and act synergistically on vascular smooth muscle cells. Circulation. 119, 1424-1432 (2009).
