Em Eletroporação vivo de Retina do rato em desenvolvimento

A caracterização funcional de genes expressos durante o desenvolvimento da retina de mamíferos ainda é um desafio significativo. Gene targeting para gerar perda constitutivo ou condicional de nocautes função permanece custo e mão de obra intensiva, bem como demorado. Adicionando a estes desafios, retina expressa genes podem ter um papel essencial fora da retina levando a confunde involuntária ao usar uma abordagem nocaute. Além disso, a capacidade de ectopicamente expressar um gene em um ganho de experiência função pode ser extremamente valiosa quando se tenta identificar um papel na especificação célula destino e / ou diferenciação terminal.

Nós apresentamos um método para a incorporação rápida e eficiente de plasmídeos de DNA na retina do rato neonatal por eletroporação. A aplicação de impulsos elétricos curtos resultados acima de um determinado campo de força em um aumento transitório da permeabilidade da membrana plasmática, facilitando a transferência de material através da membrana ^1,2,3,4. Trabalho inovador demonstrou que eletroporação poderia ser utilizada como um método de transferência de genes em células de mamíferos, induzindo a formação de poros da membrana plasmática hidrofílica permitindo a passagem de DNA altamente carregada através da bicamada lipídica ^5. Desenvolvimento técnico contínuo resultou na viabilidade da eletroporação como um método para transferência de genes in vivo nos tecidos dos camundongos múltiplos, incluindo a retina, o método pelo qual é aqui descrito ^{6, 7, 8, 9, 10.}

Solução de DNA é injetado no espaço sub-retiniano assim que o DNA é colocado entre o epitélio pigmentado da retina e retina do mouse (P0) neonatal e pulsos elétricos são aplicadas usando um eletrodo de pinça. A colocação lateral dos olhos no mouse permite a fácil orientação do eletrodo de pinça para o alinhamento do pólo negativo necessário pole-DNA-retina-positivos. Incorporação extensiva e expressão de genes transferidos podem ser identificados por dia pós-natal 2 (P2). Devido à falta de migração lateral significativo de células da retina, regiões electroporated e não electroporated são gerados. Não electroporated regiões podem servir como controles internos histológico se for o caso.

Eletroporação da retina pode ser usado para expressar um gene sob um promotor onipresente, como o CAG, ou para perturbar a função do gene usando construções shRNA ou Cre-recombinase. Expressão mais específica pode ser conseguida através da concepção de construções com os promotores de célula específica do gene. Visualização de células electroporated é conseguido usando construções bicistronic expressando GFP ou por co-electroporating uma expressão de GFP construir. Além disso, constrói múltiplas podem ser electroporated para o estudo dos efeitos do gene combinatorial ou ganho simultânea e perda de função de genes diferentes. Eletroporação da retina também podem ser utilizados para a análise genômica de cis-regulatórias elementos, gerando construções de expressão apropriada e mutantes exclusão. Tais experiências podem ser usados ​​para identificar regiões cis-regulatórias suficiente ou necessária para a expressão gênica de células específicas ^11. Experiências potenciais são limitados apenas pela disponibilidade de construir.