In vivo Elektroporatie van de ontwikkelingslanden Mouse Retina

De functionele karakterisering van genen die tot expressie tijdens de zoogdieren het netvlies ontwikkeling blijft een belangrijke uitdaging. Gene targeting op constitutieve of voorwaardelijke verlies van functie knockouts genereren blijft kosten en arbeidsintensief, maar ook tijdrovend. Toe te voegen aan deze uitdagingen, retina uitgedrukte genen kan een essentiële rol buiten het netvlies leidt tot onbedoelde verwart hebben bij het gebruik van een knock-out aanpak. Verder kan de mogelijkheid om ectopisch drukken een gen in een winst van functie experiment uiterst waardevol bij een poging om een ​​rol in het lot van de cel specificatie en / of terminale differentiatie te identificeren.

We presenteren een methode voor een snelle en efficiënte integratie van DNA plasmiden in de neonatale muis netvlies door middel van elektroporatie. De toepassing van korte elektrische impulsen boven een bepaalde veldsterkte resulteert in een voorbijgaande stijging in het plasma membraan permeabiliteit, het vergemakkelijken van de overdracht van het materiaal over het membraan ^1,2,3,4. Baanbrekende werk aangetoond dat elektroporatie kunnen worden gebruikt als een methode van de genetische overdracht in cellen van zoogdieren door het induceren van de vorming van hydrofiele plasmamembraan poriën waardoor de doorgang van sterk geladen DNA door middel van de lipide bilaag ^5. Voortdurende technische ontwikkeling heeft geresulteerd in de levensvatbaarheid van elektroporatie als een methode voor in vivo genoverdracht in meerdere muis weefsels waaronder het netvlies, de methode die is hierin ^{6, 7, 8, 9, 10} beschreven.

DNA-oplossing wordt geïnjecteerd in de subretinale ruimte, zodat DNA wordt geplaatst tussen de retinale pigment epitheel en het netvlies van de neonatale (P0) muis en elektrische pulsen worden toegepast met behulp van een pincet elektrode. De zijdelingse plaatsing van de ogen in de muis zorgt voor de gemakkelijke oriëntatie van de pincet elektrode om de nodige negatieve pool-DNA-netvlies-positieve pool uitlijning. Uitgebreide integratie en expressie van genen die overgedragen kunnen worden geïdentificeerd door postnatale dag 2 (P2). Vanwege het ontbreken van significante zijwaartse migratie van cellen in het netvlies, zijn geëlektroporeerd en niet-geëlektroporeerd regio's gegenereerd. Niet-geëlektroporeerd regio's kunnen dienen als interne histologische controles waar nodig.

Retinale elektroporatie kan worden gebruikt om een ​​gen onder een alomtegenwoordige promotor, zoals CAG uit te drukken, of om gen-functie met behulp van shRNA construeert of Cre-recombinase verstoren. Meer gerichte expressie kan worden bereikt door het ontwerpen van constructies met cel specifiek gen promoters. Visualisatie van geëlektroporeerde cellen is bereikt met behulp van bicistronische bouwt uiten van GFP of door de co-electroporating een GFP-expressie-construct. Bovendien kunnen meerdere constructies worden geëlektroporeerde voor de studie van de combinatorische gen effecten of gelijktijdige winst en verlies van functie van verschillende genen. Netvlies elektroporatie kan ook worden gebruikt voor de analyse van genomische cis-regulatorische elementen door het genereren van juiste expressie constructen en deletiemutanten. Dergelijke experimenten kunnen worden gebruikt om de cis-regulerende gebieden voldoende of vereist zijn voor cel-specifieke genexpressie ¹¹ te identificeren. Mogelijke experimenten zijn alleen beperkt door de bouw beschikbaarheid.