Electroporation في الجسم الحي من الشبكية ماوس النامية
Summary
وهناك طريقة لدمج الحمض النووي في خلايا الشبكية البلازميد الفئران لغرض تنفيذ إما مكسب أو خسارة للدراسات وظيفة<em> في الجسم الحي</em> هو المقدمة. هذا الأسلوب تستفيد من زيادة عابرة في نفاذية الأغشية البلازمية الخلية الناجمة عن تطبيق حقل كهربائي خارجي.
Abstract
توصيف وظيفي من الجينات التي أعرب عنها خلال تطوير شبكية الثدييات لا يزال يشكل تحديا كبيرا. استهداف الجينات لتوليد خسارة التأسيسية أو المشروط بالضربة القاضية وظيفة لا تزال التكاليف وكثيفة العمالة ، فضلا عن مضيعة للوقت. إضافة إلى هذه التحديات ، وأعرب الشبكية الجينات قد يكون خارج أدوار أساسية في شبكية العين مما يؤدي إلى يفند غير مقصودة عند استخدام النهج خروج المغلوب. وعلاوة على ذلك ، يمكن أن القدرة على التعبير عن ectopically الجين في اكتساب التجربة وظيفة تكون ذات قيمة للغاية عند محاولة تحديد دور في تحديد مصير الخلايا و / أو تمايز المحطة.
نقدم طريقة لدمج سريعة وفعالة من الحمض النووي البلازميدات في شبكية العين بواسطة الفأرة الولدان electroporation. تطبيق نبضات كهربائية قصيرة فوق نتائج حقل قوة معينة في زيادة عابرة في نفاذية غشاء البلازما ، وتسهيل نقل المواد عبر الغشاء 1،2،3،4. أظهر العمل الرائد الذي يمكن استخدامه electroporation كوسيلة لنقل الجينات في خلايا الثدييات بالتحريض على تشكيل ماء المسام غشاء البلازما السماح بالعبور من الحمض النووي مشحونة من خلال طبقة ثنائية المادة الدهنية 5. وقد أدى التطور التقني المستمر في جدوى electroporation كوسيلة لنقل الجينات في الجسم الحي في الأنسجة الماوس متعددة بما في ذلك الشبكية ، الأسلوب الذي يوصف هنا 6 ، 7 ، 8 ، 9 ، 10.
يتم حقن الحمض النووي حل في الفضاء تحت الشبكية بحيث يتم وضع أن الحمض النووي بين ظهارة الصباغية في شبكية العين والشبكية للفأرة (P0) الولدان والنبضات الكهربائية يتم تطبيقها باستخدام الملقط الكهربائي. الموضع الأفقي للعيون في الماوس يسمح للتوجه من السهل القطب منتاش اللازمة لمواءمة سلبية القطب القطب الحمض النووي شبكية إيجابية. يمكن التعرف على دمج واسعة والتعبير عن الجينات التي تنقل يوميا ما بعد الولادة 2 (P2). نظرا لعدم وجود هجرة كبيرة من الوحشية الخلايا في شبكية العين ، ويتم إنشاء مناطق electroporated وغير electroporated. يجوز لغير electroporated المناطق بمثابة الضوابط الداخلية النسيجي عند الاقتضاء.
ويمكن استخدام electroporation الشبكية للتعبير عن الجينات تحت المروج في كل مكان ، مثل المساعدة النقدية ، أو لتعطيل وظيفة الجين به لجنة المساواة العرقية أو يبني shRNA recombinase. لا يمكن أن يتحقق التعبير أكثر استهدافا من خلال تصميم يبني الخلية مع المروجين جين معين. ويتم تحقيق التصور من الخلايا باستخدام electroporated يبني bicistronic معربا عن GFP أو شارك في electroporating تعبير GFP بناء. وعلاوة على ذلك ، قد يكون electroporated بنيات متعددة لدراسة تأثيرات الجين اندماجي أو كسب وقت واحد وفقدان وظائف الجينات المختلفة. ويمكن أيضا أن تستخدم electroporation الشبكية لتحليل عناصر التنظيم الجيني لرابطة الدول المستقلة من خلال توليد بنيات التعبير المناسب والمسوخ الحذف. ويمكن استخدام مثل هذه التجارب لتحديد المناطق التنظيمية لرابطة الدول المستقلة ، أو ما يكفي من الخلايا المطلوبة للتعبير جين معين 11. تجارب محدودة فقط من توافر إمكانات بناء.
Protocol
Discussion
في الجسم الحي electroporation يمثل طريقة سريعة وفعالة لتحويل خلايا الشبكية مع التعبير البلازميدات الحمض النووي. هذا الأسلوب يسمح للمجرب لأداء وظيفة الحصول على الدراسات من خلال إدخال الجين ectopically الفائدة في ظل سيطرة المروج أعرب بتواجد مطلق أو لإجراء دراسات فقدان وظيفة …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة R01EY020560 – 01 ، وباحثا WM كيك في جائزة الشباب للبحوث الطبية. فإن الكتاب أود أن أشكر جوزيف Bedont لمساعدته أثناء التصوير من الاستعدادات الشبكية والحقن.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
|---|---|---|---|
| Buffer Saturated Phenol | Invitrogen | 15513-039 | N/A |
| Chloroform | J.T. Baker | 9180-03 | N/A |
| Sodium Acetate | J.T. Baker | 3470-05 | 3 M stock |
| Fast Green FCF | Fisher Biotech | BP123-10 | 10 % stock |
| Isopropyl alcohol prep | Tyco Healthcare | 6918 | N/A |
| 30-guage needle | Terumo Medical Corp. | SG2-3013 | N/A |
| Exmire microsyringe | Ito Corporation | MS*E05 | N/A |
| Tweezertrode (tweezer electrode) | BTX Instrument, Genetronics Inc. | 522 | N/A |
| Electro Square Porator (electroporator) | BTX Instrument, Genetronics Inc. | ECM 830 | N/A |
| O.C.T. Compound | Sakura Finetek USA | 4583 | N/A |
References
- Neumann, E., Rosenheck, K. Permeability changes induced by electric impulses in vesicular membranes. J. Membr. Biol. 10, 279-290 (1972).
- Turnbull, R. J. Letter: Letter: An alternate explanation for the permeability changes induced by electrical impulses in vesicular membranes. J. Membr. Biol. 14, 193-196 (1973).
- Zimmermann, U., Schulz, J., Pilwat, G. Transcellular ion flow in Escherichia coli B and electrical sizing of bacterias. Biophys. J. 13, 1005-1013 (1973).
- Kinosita, K., Tsong, T. Y. Voltage-induced pore formation and hemolysis of human erythrocytes. Biochim. Biophys. Acta. 471, 227-242 (1977).
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO J. 1, 841-845 (1982).
- Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations. Dev. Biol. 233, 13-21 (2001).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 16-22 (2004).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 1027-1032 (2007).
- Onishi, A. Pias3-dependent SUMOylation directs rod photoreceptor development. Neuron. 61, 234-246 (2009).
- Onishi, A. The orphan nuclear hormone receptor ERRbeta controls rod photoreceptor survival. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 11579-11584 (2010).
- Kim, D. S. A Core Paired-Type and POU Homeodomain-Containing Transcription Factor Program Drives Retinal Bipolar Cell Gene Expression. J. Neurosci. 28, 7748-7764 (2008).
