Un metodo rapido per High-Resolution Imaging di fluorescenza in semi-spessa fettine di cervello

Un obiettivo fondamentale sia di base e clinica delle neuroscienze è quello di comprendere meglio le identità, trucco molecolare, e modelli di connettività che sono caratteristici di neuroni nel cervello sia normale e malato. In questo senso, un grande sforzo è stato posto sulla costruzione di mappe ad alta risoluzione neuroanatomici ^1-3. Con l'espansione della genetica molecolare e progressi nella microscopia luce è venuta la possibilità di interrogare non solo morfologie neuronale, ma anche la composizione molecolare e cellulare dei singoli neuroni e delle loro reti associate ^4. Importanti progressi nella capacità di segnare e manipolare i neuroni attraverso le tecnologie transgeniche e gene targeting nei roditori ora consentire agli investigatori di sottoinsiemi neuronale 'programma' a volontà ^5-6. Probabilmente, uno dei contributi più influenti di neuroscienza contemporanea è stata la scoperta e la clonazione di geni che codificano per proteine ​​fluorescenti (PQ) in invertebrati marini ^7-8, accanto ai loro ingegneria successive per produrre una sempre maggiore cassetta degli attrezzi di giornalisti vitale ^9. Sfruttando cellula tipo-specifici promotore di attività mirate a guidare l'espressione FP in discrete popolazioni neuronali offre ora indagine neuroanatomici con precisione genetica.

Ingegneria espressione FP nei neuroni ha migliorato notevolmente la nostra comprensione della struttura del cervello e funzione. Tuttavia, i singoli neuroni imaging e le loro reti associate nei tessuti cerebrali profondi, o in tre dimensioni, è rimasta una sfida. A causa di alto contenuto di lipidi, tessuto nervoso è piuttosto opaco e auto presenta fluorescenza. Queste proprietà intrinseche biofisiche rendono difficile la visualizzazione e l'immagine neuroni fluorescente ad alta risoluzione con un microscopio confocale epifluorescente o al di là profondità di decine di micron. Per aggirare questo problema i ricercatori spesso utilizzano seriale sottile sezione imaging e metodi di ricostruzione ^10, o 2-fotone microscopia a scansione laser ^11. Svantaggi attuali a questi approcci sono associati alta intensità di lavoro di preparazione dei tessuti, o troppo costose strumentazioni rispettivamente.

Qui, vi presentiamo un metodo relativamente rapido e semplice per visualizzare le cellule fluorescente a fette topo fisso semi-densi cervello deselezionando ottici e di imaging. Nel protocollo allegato si descrivono i metodi di: 1) tessuto cerebrale di fissaggio in situ tramite perfusione intracardial, 2) la dissezione e la rimozione di intero cervello, 3) incorporando cervello stazionario in agarosio, 4) di precisione semi-densi preparazione fetta utilizzando nuovi strumenti vibratome compensazione, 5) il tessuto cerebrale da un gradiente di glicerolo, e 6) il montaggio su vetrini per microscopia ottica e z-stack ricostruzione (Figura 1).

Per la preparazione di fettine di cervello abbiamo implementato un pezzo relativamente nuovo di strumenti chiamato 'Compresstome' VF-200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html). Questo strumento è un semi-automatico microtomo dotato di un anticipo motorizzato e vibrazioni sistema blade con caratteristiche simili in funzione di vibratomes altri. A differenza di altri vibratomes, il tessuto da tagliare è montato in una spina agarosio all'interno di un cilindro di acciaio inox. Il tessuto viene estruso a spessori desiderati dal cilindro, e tagliare con la lama in avanti avanzando vibrante. La spina agarosio / sistema cilindro permette di tessuto riproducibile montaggio, allineamento e il taglio di precisione. Nelle nostre mani, il 'Compresstome' alte rese fette qualità dei tessuti per elettrofisiologia, immunoistochimica, e diretto fissa tessuto di montaggio e di imaging. In combinazione con compensazione ottica, qui abbiamo dimostrato la preparazione di semi-densi fettine di cervello fissata per imaging ad alta risoluzione fluorescenti.